[发明专利]利用DDA-DIA交替采集定量筛选红颊草莓柱头差异蛋白的方法

权利要求书

1.利用DDA-DIA交替采集定量筛选红颊草莓柱头差异蛋白的方法，其特征是依次包括以下步骤：

1）、DDA采集模式建立红颊草莓柱头蛋白肽段信息库：

将小蕾期、中蕾期、大蕾期的草莓柱头按照1:1:1的数量混合后作为样品，从而建立红颊草莓柱头蛋白肽段信息库；

将小蕾期、中蕾期、大蕾期的草莓柱头按照1:1:1的数量混合后作为样品，进行蛋白提取、定量、还原烷基化和酶解除盐，经SCX强阳离子交换-反向C18二维液相分离后进入QExactive质谱仪进行DDA模式数据，质谱得到的原始文件经Maxquant搜库鉴定获得蛋白和肽段信息列表；

2）、DIA模式采集待试样品信息：

①、质谱上机样品准备和分组

取小蕾期、中蕾期、大蕾期红颊草莓柱头，分别液氮研磨，从而分别获得相应的样品；

每个样品经处理后所得的肽段干粉用体积浓度为0.1% 甲酸水溶液进行溶解，从而得到浓度为1μg/μL的肽段溶液；

②、DIA模式采集定量数据

上述每个样品均分别进行如下操作：

取20μL肽段溶液到进样管，再加入1μL 1× iRT标准肽段溶液混匀，分别进行反向C18液相分离串联Q Exactive质谱DIA模式采集，从而获得相应的DIA原始数据文件；

C18液相流动相组分：C18 Buffer A: 0.1% 甲酸水溶液，C18 Buffer B:0.1%甲酸乙腈溶液；分离梯度：0~3min，4~7% C18 Buffer B；3~103min，7~18% C18 Buffer B； 103~113min，18~35% C18 Buffer B；113~117min，35~75% C18 Buffer B；117~120min，75% C18Buffer B；

上述每个时间段的流动相余量为C18 Buffer A；每个时间段内，C18 Buffer B的浓度均匀进行改变；洗脱流速为1ml/min；

DIA模式参数设置为：扫描时间120min，离子模式正离子，一级质谱分辨率70000@m/z200，最大注入时间50ms，扫描范围350-1300m/z；二级扫描分辨率17500@m/z200；碰撞能量27%，分设32个隔离窗口，具体为：

350-381m/z,381-398m/z,398-415m/z,415-432m/z,432-444m/z,444-456m/z,

456-468m/z,468-480m/z,480-492m/z,492-504m/z,504-516m/z,516-528m/z,

528-540m/z,540-552m/z,552-564m/z,564-576m/z,576-592m/z,592-608m/z,

608-624m/z,624-640m/z,640-656m/z,656-672m/z,672-688m/z,688-712m/z,

712-736m/z,736-766m/z,766-806m/z,806-856m/z,856-926m/z,926-1300m/z；

3）、筛选差异蛋白：

将步骤1）得到的信息库列表和步骤2）得到的DIA原始文件导入分析软件SpectronautPulsar进行匹配定量、T检验分析，

以中蕾期样品为总对照筛选出p0.05且小蕾期样品、大蕾期样品分别相较中蕾期样品表达倍数≥1.5或者≤2/3的差异蛋白。