[发明专利]一种重组基因VIII型新城疫病毒弱毒株

说明书

本发明涉及兽医病毒分子生物学技术和免疫学技术领域，公开了一株重组基因Ⅷ型新城疫病毒弱毒株NDV‑rHR09‑LaSota‑HN。所述的弱毒株NDV‑rHR09‑LaSota‑HN的保藏号为CCTCC NO:V201830。研究表明，NDV‑rHR09‑LaSota‑HN毒株毒力弱，MDT大于120h，ICPI值为0.026，免疫试验证明对新城疫强毒株有良好的免疫保护效果，经与常用疫苗株LaSota对照，以NDV‑rHR09‑LaSota‑HN株接种1日龄SPF鸡，3周后鸡的抗体水平、对流行强毒株攻毒的保护效果等优于或不低于对照组。

技术领域

本发明涉及兽医病毒分子生物学技术和免疫学技术领域，利用反向遗传操作平台对筛选获得的基因Ⅷ型毒株在F基因突变的基础上再进行HN基因片段的替换，获得了一株重组的基因VIII型新城疫病毒弱毒株。

背景技术

新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)对世界家禽养殖业危害巨大，它可以感染多种禽类，常导致养禽业产生巨大的经济损失[Alexander,D.J.2001.GordonMemorial Lecture.Newcastle disease.Br Poult Sci 42:5-22.]。该病毒在分类学上属于副粘病毒科、副粘病毒亚科、禽腮腺炎病毒属(Avulavirus)的成员[Mayo,M.A.2002.Virus taxonomy-Houston 2002.Arch Virol 147:1071-1076.]。新城疫病毒有囊膜，基因组为单股、负链、不分节段的RNA病毒，基因组结构模式为：3′-NP-P-M-F-HN-L-5′，依次编码6种结构蛋白：核衣壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)和大分子蛋白(L)即核蛋白(NP)，P，M，F，HN和L蛋白。根据对鸡的毒力，NDV毒株可以为强毒(Velogenic)、中等毒力(Mesogenic)和弱毒(Lentogen)三种类型。已有大量的研究已经阐明了病毒致病性的分子决定因素[Huang Z,Krishnamurthy S,Panda A,Samal SK.Newcastle disease virus V protein is associated with viralpathogenesis and functions as an alpha interferon antagonist.Journal ofvirology 2003Aug；77(16):8676-85.]，其中大部分是关于F和HN蛋白对病毒毒力的作用，特别是F蛋白裂解位点处的氨基酸序列是病毒毒力的主要决定因素[Seal BS.Nucleotideand predicted amino acid sequence analysis of the fusion protein andhemagglutinin-neuraminidase protein genes among Newcastle disease virusisolates.Phylogenetic relationships among the Paramyxovirinae based onattachment glycoprotein sequences.Funct IntegrGenomics 2004Oct；4(4):246-57.]。NDV毒力差异的分子基础主要决定于F0蛋白的蛋白酶裂解位点的氨基酸序列，强毒的裂解位点两端有成对的碱性氨基酸序列，其模式基序为¹¹²R/K-R-Q-K/R-R-F¹¹⁷；弱毒的裂解位点则缺少聚碱性氨基酸序列，其模式基序为¹¹²-E/G-R/K-Q-E/G-R-L¹¹⁷。HN蛋白也是NDV毒力的重要决定因素。已有的研究证明，HN蛋白氨基酸序列的长短与毒力有关，利用反向遗传操作技术，Roemer-Oberdoerfer等已证实HN蛋白的不同长度与NDV的毒力和致病性有着非常重要的关系(Roemer-Oberdoerfer A,Werner O,Veits J,et al.Contribution of thelength of the HN protein and the sequence of the F protein cleavage site toNewcastle disease virus pathogenicity.J Gen Virol.2003,84(11):3121-3129.)。HN基因编码区的长度有多种类型，所编码的HN蛋白长度有616、585、581、580、578、577、572、571个氨基酸等多种。含有616个氨基酸的HN前体蛋白只存在于无毒力的毒株中，如D26、Ulster和Queensland等毒株，在强毒株中未发现，而含有571个氨基酸的HN蛋白只存在于强毒株中，其它长度的HN蛋白在强弱毒株中均存在。