[发明专利]一种基于银纳米簇猝灭效应和多重放大技术的电化学发光生物传感器及其应用

权利要求书

1.一种基于银纳米簇双重猝灭效应和多重循环放大技术的电化学发光生物传感器，其特征是：通过目标ATP与其适体结合以及酶聚合剪切作用实现多重循环放大反应，生成大量DNA产物链，将原位合成Ag NCs的DNA接到电极上，实现电极上CdS量子点与Ag NCs与之间的ECL能量转移以及Ag NCs对电极表面附近的共反应剂的消耗，从而构建电化学发光生物传感器。

2.一种制备权利要求1所述的基于银纳米簇双重猝灭效应和多重循环放大技术的电化学发光生物传感器的方法和应用，其特征方法由下列步骤组成：

步骤1.CdS量子点的制备：采用水热合成方法合成了CdS量子点作为信号材料，在三口烧瓶中将5mmol的CdCl₂·2.5H₂O溶解于30mL二次水中，加入20μL MPA，生成白色的沉淀，之后用1.0M的NaOH调节溶液的pH为10～11，此过程中溶液的沉淀逐渐溶解，接着通氮气除氧30min，然后将新配制的0.02M的Na₂S溶液20mL溶液逐滴地加入上述反应溶液中，得到橙黄色的沉淀，继续通氮气，保持反应温度在70℃，反应3h之后停止加热，即得羧基修饰的CdS量子点，待反应液自然冷却至室温之后收集置于4℃备用。

步骤2.目标引发酶辅助循环放大反应：首先配制一定浓度梯度的ATP溶液，为10pM，1pM，100fM，10fM，1fM，100aM，10aM，1aM，0.1aM的目标物溶液，置于4℃备用。

然后，分别几个在反应管中加入10μL(1μM)HP1，再分别加入10μL各个浓度的ATP，混合均匀之后置于恒温震荡期中反应30min，之后，在反应管内加入1μM的template DNA链10μL，10μL的dNTPs，5U phi29聚合酶和5U Nt.BbvCI内切酶以及各自对应的缓冲液，混合均匀之后在在摇床里37℃温度下反应90min，接下来将反应管放在60℃的水浴环境中进行酶的灭活，最后置于4℃备用。

步骤3 银纳米簇的制备：先配置0.02M的AgNO₃的溶液，按照DNA与Ag⁺比例为1:10的比例将200μL的10μM的银序列与1μL的AgNO₃混合，在涡旋混合器上剧烈混合90s，再将反应管在4℃条件下反应30min。然后将新配制的0.01M的NaBH₄取1μL加入到反应管内，继续用涡旋混合器剧烈混合90s，最后将反应管继续放置于4℃的环境中，反应过夜，即可得到在templateDNA上生成的银纳米簇。

步骤4 生物传感器的制备：传感器制备之前，首先进行电极的处理。将金电极用0.3μm的氧化铝粉进行表面的抛光处理，之后用二次水将电极表面残留的氧化铝粉冲洗干净，最后在二次水浴中超声10min，最后吹干备用。

取制备的CdS量子点溶液，加入乙醇之后，6000rpm下离心5min，之后将沉淀收集，除去上层液体，将沉淀重新溶于等量的二次水中；用移液枪取10μL的量子点溶液均匀地滴在电极的表面，在室温下避光自然晾干，在电极表面形成一层薄膜，即得CdS修饰的金电极；接下来，将电极浸入含有EDC(20mg/mL)和NHS(10mg/mL)的溶液中，进行量子点表面羧基的活化处理，反应时间1h；反应之后，用PBS轻轻冲洗电极表面，以除去残余的EDC和NHS，然后将10μL的HP2(1μM)滴到电极的表面，在湿润的环境下避光反应4h以使HP链末端的氨基和量子点表面的羧基结合；反应之后，用PBS小心地冲洗电极表面，将没有连接的DNA除去然后用MCH进行封板处理1h，最后再进行电极冲洗。

3.根据权利要求2所述的ATP检测方法，其特征是：所述的电化学发光测试是将表面进行反应完成的电极作为工作电极，三电极体系中检测ECL信号。ECL检测液为pH为7.4的PBS溶液(0.1M)，含有K₂S₂O₈(0.1M)和KCl(0.1M),其中K₂S₂O₈作为共反应剂与量子点发生反应，检测电压范围为0～-1.5V，扫描速率为0.1V/s，光电倍增管为-600V到-800V。同时采用统一的光电倍增条件，在光窗上加盖不同波长的滤光片(400nm，425nm，440nm，460nm，490nm，535nm，555nm，575nm，620nm)，检测ECL发光强度在不同的波长内的变化。