[发明专利]单链测序文库的构建方法及其应用

说明书

本发明公开了提供了高通量测序文库的构建方法及其应用。其中，构建高通量测序文库的方法包括：将基因组DNA片段化和末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A，连接接头并扩增后，将所述DNA文库用外切酶进行消化得到单链DNA文库；利用特异性探针对连接产物进行杂交捕获，以便获得目的片段。本发明改进DNA杂交流程，将常规双链DNA模板通过酶切消化成单链，再采用环状寡核苷酸的完全封闭引入的接头和标签序列，用探针(RNA或DNA)对单链DNA模板进行捕获，可以降低杂交捕获的时间，提高探针捕获目的DNA序列的效率，降低GC区域捕获的偏好性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域。具体地，涉及涉及确定样本的目标DNA片段的靶向测序技术。更具体地，本发明提供了一种构建高通量测序文库的方法、一种确定样本的目标DNA片段的测序方法、一种用于确定样本目标DNA片段的装置以及一种用于构建样本目标DNA片段高通量测序文库的试剂盒。

背景技术

近年来崛起的新一代高通量测序技术能够同时对数十亿个DNA片段进行测序，为基础生物医学研究和临床检测提供了一个强大的工具。全基因组测序以其全面综合的检测性能广泛应用于基础科研领域，然而全基因组测序的成本和分析的复杂程度还是让科研人员倍感困难，尽管新一代测序(NGS)的通量越来越高，而费用越来越低，但它仍不是大多数遗传实验室和临床检测中心可行的选择。对于复杂疾病的研究更是如此，这类研究至少需要数百个样本，以实现足够的统计能力，这么多样本的全基因组测序，无论从成本考虑，还是从数据分析考虑，都是相对困难的。

因此另一测序技术就应运而生—目标靶向测序技术，目标靶向测序技术是通过一些不同的方法对我们感兴趣的目标DNA进行捕获制备成测序文库，再通过高通量测序进行测序分析，得到目标DNA的序列，例如外显子捕获测序，其捕获和测定大约30MB的全基因组外显子序列，其测序成本只有全基因组测序的百分之一。目标靶向测序技术杜宇庞大的人类或高等生物的基因组，可以成百上千倍地提高测序效率，及大地提高样本的通量，是高通量测序技术更好地应用于临床检测领域，目前发展了多种目标靶向测序技术，其主要分为一种是基于探针的捕获的富集技术，另一种是基于多重PCR的富集技术。

基于多重PCR的目标靶向测序技术以其简便的实验流程应用于一些临床检测领域，但其大多只能捕获小于1MB的区域，大都只能检测已知突变，且检测的稳定性差，这些特性都限制了其在临床的应用。基于探针的目标靶向测序技术能够捕获大于10mb以上的区域，且稳定性好，可以检测多种类型的突变，并且可以定制不同的检测区域，在临床应用具有极大的潜力。

然而，基于探针捕获的目标靶向测序技术其建库流程长，探针为了能够充分地和目标区域结合需要杂交1-2天甚至更长的时间，大大限制了临床检测的时效性。另外杂交捕获的效率有限(通常只有50-60％的捕获效率)，其浪费在非目标区域的数据也无形中增加了探针捕获的成本。

发明内容

本发明旨在解决现有技术问题的至少之一。本发明的第一方面提供了如下的技术方案：

将基因组DNA片段化，以便获得DNA片段；

将所述DNA片段进行末端修复，以便获得经过末端修复的DNA片段；

在所述经过末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A，以便获得具有粘性末端A的DNA片段；

将所述具有粘性末端A的DNA片段与接头相连，以便获得连接产物；

将所述连接产物通过一条带有5端磷酸化的引物和另一条5端不带有磷酸化的引物进行PCR扩增，得到DNA文库；

将所述DNA产物用外切酶进行消化得到单链DNA文库；

在本发明一个优选的实施例中，所述外切酶为lambda核酸外切酶；