[发明专利]检测CHO核酸残留的引物、探针、试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开了一种检测CHO核酸残留的引物、探针、试剂盒及检测方法。所述检测CHO核酸残留的引物对包括：第一引物和第二引物，其序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。所述探针的序列如SEQ ID NO.3所示。所述试剂盒包括前述引物对和探针。所述CHO核酸残留的检测方法包括：提供待检测的DNA样本，使其与前述试剂盒的PCR扩增检测的常规组件混合，形成混合液；之后利用所述试剂盒所包含的引物对与探针对所述混合液进行PCR扩增；对PCR扩增产物进行检测，判断DNA样本中CHO核酸的残留情况。本发明的检测方法及试剂盒能准确的检测出中国仓鼠源性生物制品中CHO核酸的残留情况，应用前景广阔。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，更具体地，涉及核酸分子生物学检测方法，特别是指一种中国仓鼠卵巢细胞(CHO)的实时荧光定量PCR检测所用的引物、探针及相应试剂盒，以及利用该试剂盒检测CHO核酸残留的实时荧光定量PCR检测方法。

背景技术

CHO细胞即中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary)，该细胞具有不死性，可以传代百代以上，是目前生物工程上广泛使用的细胞。全世界批准正式应用于人类疾病治疗或疾病预防的基因工程产品约有三十多种，其中CHO表达系统能准确的转录后修饰表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能，使它最接近于天然蛋白分子；其次，CHO细胞既可贴壁生长，又可以悬浮培养，有较高的耐受剪切力和渗透压能力，培养体积能达到1000L以上；再次，CHO细胞具有重组基因的高效扩增和表达能力；而且CHO具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分离纯化。因此CHO成为表达复杂生物大分子的理想宿主。

CHO细胞表达疫苗的种类不多，多数处于研究阶段。目前只有CHO表达乙肝疫苗已投入生产，CHO细胞表达的蛋白更接近人体来源的表面抗原，这是除酵母表达乙肝疫苗以外，唯一已用于人类使用的基因工程亚单位疫苗。1991年中国预防医学科学院病毒学研究所联合长春生物制品研究所等单位研制成功了由CHO细胞表达的基因工程乙肝疫苗，并于1992年批量上市。在美国以酵母表达的乙肝疫苗为主的同时，CHO表达的乙肝疫苗占据了欧洲市场。除乙肝疫苗以外，目前Epstein-Barr病毒(EBV)、EPO、艾滋病病毒、丙肝病毒、水痘-带状疱疹病毒亚单位疫苗等领域在CHO细胞中的表达在国内外均有研究。

随着基因工程技术的飞速发展，越来越多的哺乳动物细胞，尤其是连续传代细胞系用于生产疫苗和治疗性生物制品，其用量随着临床治疗效果的需求越来越大，需要长期反复用药的生物制品也越来越多。同时疫苗的使用者为健康人群，这使得药品监管部门更加重视生物技术产品的安全性，其中DNA残留量的质量控制一直是人们关注的热点。由于CHO细胞等传代细胞调控生长的基因失调，使其具有无限的寿命，因此一般认为传代细胞系的DNA具有使其他细胞生长失控和产生致瘤活性的潜能，需要对其DNA残留量进行严格的质量控制。目前，国内主要使用DNA探针杂交法和荧光染料法作为残余DNA的检测方法。以地高辛标记斑点杂交法为代表的DNA杂交法实验周期长，操作复杂，干扰因素多，重复性差，仅能半定量分析，且存在非特异性显色，有时也会出现假阳性。荧光染料法测定对象为所有双链DNA，不能检出单链DNA，且没有序列特异性。国外对于宿主细胞DNA残留的检测，一般采用定量PCR技术、SYBR green染料法或者探针标记法。1997年，食品药品监督管理局(Food andDrug Administration，FDA)规定，在美国使用的细胞系疫苗DNA残留量不能超过10pg/剂；《中国药店》三部(2015版)对于CHO细胞表达制品一般要求宿主DNA残留量不超过100pg/剂。而2009年美国药典(United States Pharmacopoeia，USP)收录了杂交法、阈值法和Q-PCR法，至2015年底USP仅收录高灵敏度、高特异性的Q-PCR法作为残留DNA检测的推荐方法。2018年国家质量监督检验检疫总局发布了CHO细胞表达产品残留DNA检测Q-PCR方法。由此可见Q-PCR法将成为国际公认的残留DNA检测方法。