[发明专利]一种分离细胞的方法

说明书

本发明提供了一种分离细胞的方法，所述方法对基于Ficoll分离液的密度梯度离心法进行改进，创造性地在Ficoll中加入液体石蜡，有效促进血液样品在Ficoll上液面的稳定分层以及单个核细胞与血细胞的高效分离；将分离得到的单个核细胞进行磁珠分选，辅以注射器的负压抽吸和培养基的洗脱步骤，各步骤各条件协同增效，相互配合，极大地缩短了分离纯化时间，降低了操作难度及精力消耗，提高了分离纯化效率，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值，为细胞分离提供了新的思路和方法。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种分离细胞的方法。

背景技术

造血干细胞是一类成体多能干细胞，经多层级发育分化形成成熟的血液系统。造血干细胞是血液学研究领域的主要对象，是现代实验血液学研究的基础。造血干细胞的分离纯化及基因操作是血液学研究领域中最常用到的主要实验技术手段之一，如何能高效快捷地分离纯化造血干细胞是进行研究工作的首要任务。

当前实验室主流策略是通过两步法方案分离得到纯化的造血干细胞：首先去除绝大部分红细胞，保留白细胞；随后在白细胞中加入抗CD34磁珠进行孵育结合，经磁力架分选得到纯化的CD34⁺造血干细胞。在此基础上还有衍生的三步法分离造血干细胞等方案；现以衍生的三步法为例，详细介绍现有技术中造血干细胞分选的主要步骤及流程：第一步是粗分离和体积浓缩：主要是利用羟乙基淀粉沉淀红细胞，100mL肝素抗凝脐血与6％羟乙基淀粉(HES)按5:1混合，羟乙基淀粉终浓度为1％，经自然沉降60min，小心吸取上层液400g离心10min回收单个核细胞，10mL PBS悬浮；第二步是单个核细胞分离：15mL离心管中加入5mLFicoll(密度1.077g/mL)，在Ficoll液相表面小心滴加10mL左右的细胞悬液，经慢升慢降400g离心30min，得到白细胞层，小心吸取中间细胞层，漂洗后0.5-1mL体积悬浮；第三步即特异性抗体标记并进行磁珠分选。细胞悬液中加入FcR封闭抗体和CD34⁺磁珠，孵育30min以上。对美天旎分选MS柱进行浸润、细胞过柱。漂洗去除非标记细胞后将MS柱移离磁铁，用PBS将特异标记的CD34+细胞退出MS柱，经400g离心回收细胞后种于培养基中。

上述技术方案，具有明显不可逾越的缺点：耗时长：需要2个人长达5小时以上才能分选得到造血干细胞；效率低：当前的三步法步骤繁琐，非精通人员很难熟练掌握；消耗精力：多个步骤需要小心翼翼的操作，需要全神贯注集中精力，劳动强度大。

虽然现阶段也有市场化的中间带隔层筛板的离心管销售，这种分层离心管也可以起到锐化分层界面的作用，但是该离心管价格昂贵，单管价格在50元左右，不适合长期规模化应用；而本发明创新应用液状石蜡作为分层封层剂，医用级别的液状石蜡价格低廉，完全可以更高性价比的解决问题。