[发明专利]一种重组H7N9亚型禽流感病毒株、灭活标记疫苗及其制备方法

权利要求书

1.一种重组H7N9亚型禽流感病毒株，其特征在于，以H7N9亚型禽流感病毒JD/17病毒株为母本病毒株，用H3亚型的氨基酸序列替换所述JD/17病毒株的HA蛋白中氨基酸序列；

所述H3亚型的氨基酸序列见序列表中SEQ ID No.1；

所述JD/17病毒株中的HA蛋白中氨基酸序列见序列表中SEQ ID No.2；

所述H7N9亚型禽流感病毒JD/17病毒株的保藏编号为CCTCC NO.V201862。

2.权利要求1所述的重组H7N9亚型禽流感病毒株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取H7N9亚型禽流感病毒JD/17病毒株的总RNA，反转录，得到cDNA；

(2)以所述cDNA为模板，用引物对KS-H7-1和JDH7H3-1-R扩增HA-1基因片段，用引物对JDH7H3-2-F和KS-H7-2扩增HA-2基因片段；

所述KS-H7-1的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示；

所述JDH7H3-1-R的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.4所示；

所述JDH7H3-2-F的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.5所示；

所述KS-H7-2的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.6所示；

(3)以步骤(2)得到的HA-1基因片段和HA-2的基因片段为模板进行重叠PCR扩增，得到序列替换的HA基因片段；

(4)将所述步骤(3)中序列替换的HA基因片段与Blunt 3载体连接，得到的中间过渡质粒，经测序验证序列正确后，用BsmBI进行酶切，得到的酶切的目的产物克隆至pHW2000载体，提取质粒；将提取的质粒与JD/17病毒株的其他7个基因的pHW2000载体构建的表达质粒进行转染，拯救得到重组H7N9亚型禽流感病毒株。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述HA-1基因片段和HA-2基因片段的扩增程序独立为：

94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火40s，72℃延伸1min 30s，35个循环；72℃延伸10min。

4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述HA-1基因片段和HA-2基因片段的扩增体系独立为：2.5μL 10×PCR缓冲液，0.5μL 10mM dNTP，0.5μL25mM上游引物，0.5μL 25mM下游引物，0.5μL高保真酶，2μL DNA模板和18.5μL超纯水。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述重叠PCR扩增的程序为：

94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火40s，72℃延伸1min40s，35个循环；72℃延伸10min。

6.一种重组H7N9亚型禽流感病毒标记疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

A.将权利要求1所述重组H7N9亚型禽流感病毒株或权利要求2～5任意一项所述制备方法制备的重组H7N9亚型禽流感病毒株接种SPF鸡胚，孵育，得到病毒尿囊液；

B.将所述病毒尿囊液和甲醛溶液混合，得到的混合液转移4℃的条件下振摇灭活24h，得到灭活病毒尿囊液；

C.当所述灭活病毒尿囊液的血凝效价4log2时，将所述灭活病毒尿囊液依次与吐温80和白油混合，得到灭活病毒尿囊液混合物；

D.将所述灭活病毒尿囊液混合物乳化，得到重组H7N9亚型禽流感病毒标记疫苗。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述甲醛溶液的体积浓度为4％。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述病毒尿囊液和甲醛溶液的体积比为43:7。

9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述灭活病毒尿囊液、吐温80和白油的体积比为24:1:75。

10.权利要求6～9任意一项所述制备方法制备的重组H7N9亚型禽流感病毒标记疫苗。