[发明专利]一种糖基转移酶在合成甘草酸中的应用

说明书

本发明公开了一种糖基转移酶，可以催化甘草次酸糖基化合成单葡萄糖醛酸基甘草次酸和甘草酸，属于生物技术领域。该糖基转移酶可用于体外酶法合成单葡萄糖醛酸基甘草次酸和甘草酸。并且，该糖基转移酶可以用于微生物体内全合成单葡萄糖醛酸基甘草次酸和甘草酸。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种糖基转移酶，尤其涉及一种糖基转移酶在转糖基化生成单葡萄糖醛酸基甘草次酸和甘草酸中的应用。

背景技术

单葡萄糖醛酸基甘草次酸(GAMG)和甘草酸(GL)是五环三萜类化合物甘草次酸(GA)的糖甙衍生物，糖基转移酶通过在GA的C-3位连接1-2个葡萄糖醛酸分别生成GAMG和GL。作为GA的糖甙衍生物，GAMG和GL也具有镇咳祛痰、消炎抑菌、抗肿瘤及治疗艾滋病等多种药理活性，是一类具有重要药理活性的天然产物；同时，糖侧链的添加提高了GAMG和GL的甜度和极性，其中GAMG的甜度是蔗糖的941倍，作为新型甜味剂用于食品工业，GL的极性是GA的27倍，作为保湿剂用于化妆品行业。综上所述，GAMG和GL具有重要的医药和工业应用价值。因此,获得大量、高纯度的GAMG、GL成为现代工业的研究热点。

甘草又名国老、灵通，具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药等重要的药用价值；同时，由于甘草是一种根系十分发达的多年生豆科植物，其具有防风固沙，稳定生态，减少土地荒漠化等重要的生态价值。我国甘草主要分布于宁夏、甘肃、青海、内蒙古、新疆和陕西榆林地区，近几年甘草作为药材、食物及化妆品的市场需求量猛增，野生资源的过度采挖导致甘草药材产量和质量急剧下降，同时也加速了我国北方荒漠化的扩展，严重影响了生态环境。

目前获得GAMG和GL的主要方式是从甘草根中提取，以乙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇等有机溶剂作为萃取液，通过超临界二氧化碳萃取、溶剂萃取和色谱柱分离几种方法的组合从甘草根中分离获得GAMG和GL。然而GAMG和GL在甘草跟中的积累量较少，其中GAMG在甘草根干重中的含量不足1‰，GL在甘草根干重中的含量在2％左右，如果直接从植物中提取存在工艺复杂、能耗高、生产周期较长等问题，且需要消耗大量的甘草资源，严重影响我国北方的生态环境。此外，GAMG和GL由于其分子结构的复杂性使得化学合成也难以实现。

近年来,合成生物学的快速发展为稀有天然产物的制备开辟了一条新的有效途径。例如，Keasling JD课题组以酿酒酵母为底盘宿主，通过在底盘宿主中引入青蒿酸的合成途径并对代谢途径不断优化使青篙酸的产量达到25g/L(Nature,2006,440:940-943；Nature,2013,496:528-532)；Stephanopoulos G课题组利用大肠杆菌为底盘宿主，通过在底盘宿主中引入紫杉二烯的合成途径首次合成了紫杉二烯(Science,2010,330:70-74)，其后又将紫杉二烯的合成途径拆分成两部分，分别构建到大肠杆菌和酿酒酵母中，并通过同培养的方式，实现了紫杉二烯产量的大幅提升，达到33mg/L(Nature Biotechnology,2015,33(4):377-83)。综上所述，以微生物作为底盘宿主，通过在底盘宿主中重建植物次生代谢产物的生物合成途径，用以制备高附加值的植物次生代谢产物具有出良好的应用前景。此外，李春教授课题组在酿酒酵母中构建了GA的生物合成途径，通过代谢调控及发酵过程优化，GA的产量达到1.518mg/L以上(专利申请号201610965315.9)。这为体外酶法合成或微生物体内全合成GAMG、GL奠定了基础。然而与GAMG、GL合成相关的糖基转移酶报道较少，糖基转移酶是生物界广泛存在的多基因家族蛋白，只在少数植物中被克隆，通过酶活性方法进行鉴定的则更少，其中参与三萜皂甙的糖基转移酶仅在拟南芥、蒺藜苜蓿、罗汉果等植物中进行了研究。近期，刘春生课题组鉴定了甘草中催化GA合成GAMG的糖基转移酶基因(NewPhytol,2016,212(1):123-35)。目前仍然没有与GL合成相关的糖基转移酶基因的报道。

通过以GA为底物在体外酶法转化合成或微生物体内全合成的方法，可提高GAMG和GL的产量，然而这两种方法都需要获得可催化GA合成GAMG和GL的糖基转移酶基因，至今仍没有此功能基因的报道。

发明内容