[发明专利]一种基于普鲁士蓝的电化学免疫传感器及基于该传感器所建立的电化学免疫传感方法和应用

权利要求书

1.一种基于普鲁士蓝的电化学免疫传感器的制备方法，所述电化学免疫传感器是由基底电极为玻碳电极，其表面依次修饰壳聚糖-普鲁士蓝纳米复合物、金纳米粒子和肿瘤标志物捕获抗体组成，其特征在于，所述电化学免疫传感器的制备方法包括以下步骤：

（1）壳聚糖-普鲁士蓝纳米复合物的制备

向5mL 5mg/mL壳聚糖的质量分数为1%醋酸溶液中加入2mL含有50mM FeCl₃、50mM K₃Fe(CN)₆和1.0M KCl的质量分数为0.1%醋酸溶液，混合均匀后升温至95℃，搅拌下反应12h；所得产物经10000rpm离心25min，弃去上清液，再使用质量分数为1%醋酸溶液洗涤后重新分散于5.0mL质量分数为 1%醋酸溶液中，即可得到CS-PB纳米复合物；

（2）电化学免疫传感器的制备

向玻碳电极上滴加5µL CS-PB纳米复合物，室温晾干之后向其表面滴加8µL平均粒径为13nm的金纳米粒子，室温组装8h；用超纯水洗净后，继续滴加3µL 0.5mg/mL CEA捕获抗体，4℃静置反应过夜；用pH=6.9的PBS缓冲溶液洗净后，继续滴加8µL含有质量分数为2% BSA的pH=6.9 PBS缓冲溶液，室温封闭60min；最后将所得电极用含有质量分数为0.05%吐温-20的pH=6.9 PBS缓冲溶液及pH=6.9 PBS缓冲溶液交替洗净、晾干，即得。

2.一种基于普鲁士蓝的电化学免疫传感器的电化学免疫传感方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）电化学免疫传感器的制备

向5mL 5mg/mL壳聚糖的质量分数为1%醋酸溶液中加入2mL含有50mM FeCl₃、50mM K₃Fe(CN)₆和1.0M KCl的质量分数为0.1%醋酸溶液，混合均匀后升温至95℃，搅拌下反应12h；所得产物经10000rpm离心25min，弃去上清液，再使用质量分数为1%醋酸溶液洗涤后重新分散于5.0mL质量分数为 1%醋酸溶液中，即可得到CS-PB纳米复合物；向玻碳电极上滴加5µLCS-PB纳米复合物，室温晾干之后向其表面滴加8µL平均粒径为13nm的金纳米粒子，室温组装8h；用超纯水洗净后，继续滴加3µL 0.5mg/mL CEA捕获抗体，4℃静置反应过夜；用pH=6.9的PBS缓冲溶液洗净后，继续滴加8µL含有质量分数为2% BSA的pH=6.9 PBS缓冲溶液，室温封闭60min；最后将所得电极用含有质量分数为0.05%吐温-20的pH=6.9 PBS缓冲溶液及pH=6.9 PBS缓冲溶液交替洗净、晾干，即得；

（2）脲酶功能化硅纳米探针的制备

向700µL 50mM pH=7.4 PBS缓冲溶液中加入100µL 5mg/mL粒径为100nm的氨基化硅纳米球分散液和200µL质量分数为2.5%的戊二醛溶液，室温下搅拌反应3h；所得产物经离心后弃去上清液，再用PBS缓冲溶液洗净之后重新分散于1.0mL PBS缓冲溶液中；继续向其中加入10µL 1.0mg/mL的CEA信号抗体，室温混匀反应1h后加入25μL 20mg/mL脲酶，继续混匀反应2h；所得产物经过离心后除去上清液，再重新分散于500µL含有质量分数为2% BSA的PBS缓冲溶液中，室温封闭反应1h即得；将得到的脲酶功能化硅纳米探针经反复离心、洗净之后分散于1.0mL 50mM pH=6.9 的PBS缓冲溶液中即得脲酶功能化硅纳米探针分散液，于4℃保存待用；

（3）标准溶液中肿瘤标志物CEA的检测

向步骤（1）制备的电化学免疫传感器表面滴加8µL不同浓度的CEA标准溶液，室温下温育反应50min后采用pH=6.9的PBST溶液及PBS缓冲溶液交替洗净；继续滴加8µL步骤（2）制备的脲酶功能化硅纳米探针分散液，室温下温育反应50min后再次用pH=6.9的PBST溶液及PBS缓冲溶液交替洗净；再滴加8µL含有0.1M尿素和0.1M多巴胺的水溶液，室温反应20min后用超纯水洗净；最后置于含有0.1M KCl的50mM pH=6.9 PBS缓冲溶液中，通过示差脉冲伏安法在0.7-0V范围内记录其电流响应值，从而检测出标准溶液中CEA的含量；

（4）血清样品中CEA蛋白质标记物的检测

取临床人血清样品，每个样品分别进行5个平行试验，向步骤（1）中制备好的电化学免疫传感器表面依次滴加8μL血清样品和步骤（2）制备的8µL脲酶功能化硅纳米探针分散液，室温下温育反应50min后再次用pH=6.9的PBST溶液及PBS缓冲溶液交替洗净；再滴加8µL含有0.1M尿素和0.1M多巴胺的水溶液，室温反应20min后用超纯水洗净；最后置于含有0.1MKCl的50mM pH=6.9 PBS缓冲溶液中，通过示差脉冲伏安法在0.7-0V范围内记录其电流响应值，从而检测血清样品中CEA的含量。