[发明专利]单细胞线粒体拷贝数检测方法

说明书

单细胞线粒体拷贝数检测方法，包括以下步骤：（1）、引物和探针设计：针对线粒体DNA11778位点G>A突变设计一对产物长度约1000bp的引物（序列1和序列2）用于标准品制作，一对Taqman探针（序列3‑6）用于检测；（2）、单细胞裂解和检测：利用配制的裂解液处理样本后直接行Taqman定量检测；（3）、数据分析：Ct值标准曲线法计算线粒体拷贝数；本发明总体操作步骤简单，对操作人员的技术水平要求低，而且数据分析方法简单，只要具有基本的Excel知识即可分析，解决了临床上对于单细胞线粒体拷贝数检测的目的，适用于临床推广。

技术领域

本发明涉及一种单细胞线粒体拷贝数检测方法。

背景技术

线粒体是真核细胞产生能量的重要细胞器，它含有自己的基因组，拥有相对独立的DNA复制、转录和翻译系统，是半自主性的细胞系，负责细胞能量代谢和自由基生成。线粒体含有自己的DNA，哺乳动物线粒体DNA（MitochondrialDNA，mtDNA）是一个全长为16569bp左右的双链闭环分子，它含有37个基因和1个非编码控制区域，这个区域就是D环，具有控制mtDNA转录和翻译的调节序列，每个细胞中只有一组核基因组，但可以具有上百个线粒体，每个线粒体中又含有1-15个不等的mtDNA分子。细胞氧化呼吸链的正常运转需要一定数目结构完整和功能健全的线粒体，而线粒体又依赖于每个mtDNA分子结构的完整性和一定的数目。因此mtDNA的拷贝数对于细胞的作用意义重大，快速灵敏地检测mtDNA拷贝数的方法对于基础研究和临床应用都十分重要。

线粒体相关的遗传疾病多由于mtDNA的突变，而突变主要以单碱基突变为主。例如Leber遗传性视神经病（LeberHereditary Optic Neuropathy，LHON）、乳酸酸中毒及卒中样发作综合征（Mitochondrial Encephalomyopathy, Lacticadidosis, And Stroke-likeepisodes, MELAS），慢性进行性眼外肌瘫痪（CPEO）、Keams-Sayre综合征（KSS）等，此类疾病具有明显的剂量效应，即突变比例与疾病的症状和表现程度相关。通常情况下，一个细胞质中的几千个mtDNA分子在某一个特定位点上都为同一序列，此细胞可以称为同质，但如果同一个细胞几千个mtDNA分子中某一位点同时存在正常基因和突变基因，就称为杂质。当突变的mtDNA数目超过一定比例时，就会出现临床症状。因此在单细胞和胚胎水平检测突变mtDNA的比例对于疾病临床表现的预测显得尤为重要。

目前已报道的对于mtDNA的定量技术存在以下不足之处：(1)需要提取DNA；(2)检测技术多针对体细胞和血样，检测精度低，检测需要大量的样本；(3)采用模型拟合的方法进行定量，影响因素很多，不同模型，不同实验流程产生的结果不一致；(4)对chrM的测量单位的定义不确定；(5)目前的应用于胚胎、卵子以及单个细胞时结果不稳定，且只能检测线粒体的拷贝数而不能检测比例。

发明内容

本发明为了解决现有技术中的不足之处，提供一种操作简单、检测周期短、对操作人员技术水平要求低的单细胞线粒体拷贝数检测方法。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：单细胞线粒体拷贝数检测方法，包括以下步骤：

（1）、探针和引物设计：针对线粒体DNA11778位点设计相应的引物，首先在线粒体DNA11778位点上下游序列设计一对产物约为1000bp的引物作为用于标准品制作的引物（序列1和序列2）；针对线粒体DNA11778位点G>A突变，设计一对Taqman探针，包括不带突变VIC探针（序列3）、携带突变的FAM探针（序列4）以及探针所需的引物（序列5和序列6），

引物序列如下：

序列1：CAACAACCTATTTAGCTGTTCCCC；

序列2：GTAAGGCGAGGTTAGCGAGG；