[发明专利]一种用于检测猪急性腹泻冠状病毒的套式PCR引物及试剂盒

说明书

本发明涉及一种用于检测猪急性腹泻冠状病毒的套式PCR引物及试剂盒，属于生物技术领域，所述套式PCR引物包括：(1)外套引物，包括SEQ ID No.1所示核苷酸序列的上游引物和SEQ ID No.2所示核苷酸序列的下游引物；(2)内套引物，包括SEQ ID No.3所示核苷酸序列的上游引物和SEQ ID No.4所示核苷酸序列的下游引物。本发明还提供包含上述套式PCR引物的试剂盒。本发明提供的套式PCR引物及试剂盒用于检测猪急性腹泻冠状病毒，兼具高灵敏度、便捷性和特异性强的优点。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测猪急性腹泻冠状病毒的套式PCR引物及试剂盒。

背景技术

2017年2月，在广东的腹泻哺乳仔猪中分离到一种新现的类似蝙蝠-HKU2的猪急性腹泻冠状病毒(又称猪肠溶性alpha冠状病毒，SADS-CoV)，这种猪急性腹泻冠状病毒引起的临床症状与其他冠状病毒如猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒、轮状病毒和猪德尔塔冠状病毒等引起的腹泻症状非常相似，以水样腹泻为主要特征。这是从猪群中发现的第五种冠状病毒，与之前发现的引起猪腹泻的冠状病毒(传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪丁型冠状病毒)类似，SADS-CoV引起的疾病可致新生哺乳仔猪急性剧烈水样腹泻，死亡率可达100％。因此，SADS-CoV引起的腹泻对当前生猪生产造成非常严重的危害，也是困扰养殖业中的难题之一。

随着我国养殖业不断走向现代化养殖模式的超大规模化养殖场，新病原的发现和爆发频率高，给养猪业造成巨大经济损失，对养殖业是巨大的挑战。目前，SADS-CoV的诊断方法还不健全，主要依靠常规PCR、荧光定量PCR和病毒分离等诊断手段。套式PCR是在常规PCR的基础上发展起来的，不仅保留常规PCR的优点，同时还较大的提高了检测的灵敏性、特异性和重复性。此外，套式PCR需要的仪器设备和对人员技术要求不需要荧光定量PCR的高，可以在临床上大面积推广和使用。因此，建立猪急性腹泻冠状病毒套式PCR检测引物组及试剂盒十分必要。本发明根据猪急性腹泻冠状病毒的N基因设计引物组，可用于建立高效、准确、快速的分子生物学诊断技术。

发明内容

针对现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种用于检测猪急性腹泻冠状病毒的套式PCR引物及试剂盒，本发明提供的套式PCR引物及试剂盒用于检测猪急性腹泻冠状病毒，兼顾高灵敏度、便捷性、特异性强的优点。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的技术方案之一是提供一种用于检测猪急性腹泻冠状病毒的套式PCR引物，其包括如下引物：

(1)外套引物，包括SEQ ID No.1所示核苷酸序列的上游引物和SEQ ID No.2所示核苷酸序列的下游引物；

(2)内套引物，包括SEQ ID No.3所示核苷酸序列的上游引物和SEQ ID No.4所示核苷酸序列的下游引物。

其中，该外套引物扩增的DNA片段大小为650bp，其核苷酸序列序列如SEQ ID:No.5所示。该内套引物扩增的DNA片段大小为291bp，其核苷酸序列如SEQ ID:No.6所示。

本发明的技术方案之二是提供一种用于检测猪急性腹泻冠状病毒的试剂盒，其包括如前所述的套式PCR引物。

在本发明中，所述试剂盒还包括反转录试剂。

优选地，所述的试剂盒，其包括：

(1)反转录试剂：MgCl₂、缓冲液、dNTP mix、RNA酶抑制剂、反转录酶、随机引物和灭菌双蒸水；

(2)套式PCR试剂：

外套PCR预混液：DNA聚合酶、缓冲液、权利要求1所述的外套引物和灭菌双蒸水；