[发明专利]一种15N代谢标记蛋白质结合质谱平行反应监测定量的方法

说明书

本发明公开了一种¹⁵N代谢标记蛋白质结合质谱平行反应监测定量的方法，¹⁵N代谢标记的内参蛋白可以准确地反映待检测内源蛋白的结构、状态，与待检测蛋白具有相同的酶解效率，解决了质谱选择追踪定量过程中内参肽离子强度信号受蛋白酶消化、共洗脱基质、样品组成、仪器状态等影响导致的不重现问题，同时提高质谱平行反应监测定量的效率；另外，本发明提供的方法可以产生多种用于平行反应监测的定量多肽，提高了定量准确性并降低合成多肽的成本，且该方法能够用于定量蛋白组学研究、对蛋白标志物的检测，医疗诊断、环境卫生，食品安全检测，司法鉴定等有很大的帮助。

技术领域

本发明涉及质谱检测的分析领域，尤其是一种¹⁵N代谢标记蛋白质结合质谱平行反应监测定量的方法。

背景技术

质谱平行反应监测(Parallel reaction monitoring，PRM)技术作为一种质谱检测的分析方法，具有特异性强、灵敏度高、准确度高、重现性好、线性动态范围宽、自动化、高通量的突出优点，这些特质能够满足今天很多研究领域的迫切需要。通过PRM技术进行实时的定量监测可以进行药代动力学、临床诊断、违禁药物检查、食品化妆品等工业质量控制、环境检测、农业植物学研究以及代谢组学和蛋白质组学生物标志物的发现等相关研究。

在PRM靶向追踪定量技术中，内参物的选择对于靶向定量的成功至关重要。目前内参物都采用体外化学合成稳定同位素标记多肽的方式完成，由于氨基酸组成与靶标蛋白质一致，只是稳定同位素的引入导致多肽质量发生变化，因此在一级色谱时具有相似的滞留时间，从而可利用其与样品混合进行目的蛋白质的平行反应监测。

在样品检测过程中掺入化学合成的内参多肽进行靶向追踪，由于受到不在同一体系内酶解、不能完全共洗脱、仪器状态等因素影响，使得质谱中产生的离子强度信号并不具有稳定的可重复性。因此，最理想的靶向追踪定量内参物应是与靶标组成和结构相一致的蛋白质，而不是体外化学合成的多肽。

基于质谱的平行反应监测定量的方法对临床检测具有很高的应用前景，具备取代抗体检测的潜力。但目前PRM技术仍存在许多问题。其广泛接受的做法之一是使用体外合成的重标记多肽(如¹³C，³H等)来测量内源性蛋白质。这种方法虽简单，但存在一些问题。首先，这种方法需要前期实验以及大量数据分析以确定合成的目标肽段。第二，不同批次样品的蛋白质酶消化过程会产生显著的差异。因此，控制消化步骤是很重要的。结果表明，合成肽段不能准确反映测定的内源蛋白质的绝对量，差异常超过10倍。第三，定量仅限于与合成肽段相同的内源肽段，而不是整个蛋白质序列，相比蛋白靶标，另一个缺点是合成多肽价格昂贵。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供一种¹⁵N代谢标记蛋白质结合质谱平行反应监测定量的方法，能够更准确、重现性地测定内源性蛋白质浓度。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种¹⁵N代谢标记蛋白质结合质谱平行反应监测定量的方法，包括以下步骤：

a)以¹⁵N代谢标记内参蛋白，得到¹⁵N标记的蛋白；

b)向待测样品中加入步骤a)得到的¹⁵N标记的蛋白，并进行电泳，得到蛋白凝胶；

c)将步骤b)得到的蛋白凝胶进行胶内酶解，得到酶解样品；

d)将步骤c)得到的酶解样品进行质谱检测，并将质谱检测结果通过PRM进行定量分析。

优选地，所述内参蛋白合成方式为¹⁵N代谢标记合成

优选地，步骤d)中质谱检测采用的是液相色谱串联质谱仪PRM监测。