[发明专利]高效液相色谱法检测破囊壶菌中角鲨烯的方法

说明书

本发明公开了高效液相色谱法检测破囊壶菌中角鲨烯的方法，包括如下步骤：(1)角鲨烯标准曲线的建立；(2)从破囊壶菌发酵液中提取角鲨烯：将破囊壶菌放入M4培养基中发酵培养，菌液离心，去上清，灭菌水洗，冻干，冻干菌体加入氯仿的甲醇溶液，匀质机破碎，氮吹干，加入NaOH溶液，涡旋，60℃水浴；取出，冷却至室温，加入正己烷萃取，上层萃取液为角鲨烯粗提待测样品；(3)使用高效液相色谱对所述角鲨烯粗提待测样品进行检测，得到峰面积，代入回归方程，得到角鲨烯含量；本发明样品的分析时间短，角鲨烯峰与其他杂质峰得到很好分离，出峰时间早，检测效率高，且灵敏度高，准确性好，是一种简便、快速、准确、环保的检测方法。

技术领域

本发明涉及破囊壶菌的高附加值活性产物的检测技术领域，特别是涉及一种高效液相色谱法检测破囊壶菌中角鲨烯的方法。

技术背景

角鲨烯(squalene,C₃₀H₅₀)是一种生物合成的全反式三萜类化合物，属于一种不饱和烃。是一种天然的抗氧化剂。角鲨烯的生理功能与其抗氧化能力密切相关。具有一定的抗紫外线的能力，可以降低机体的氧化损伤。有研究表明，角鲨烯可以降低细胞中胆固醇的含量，并且可以对心脏起到保护作用，加强心肌膜的稳定，保护心肌膜免受氧化损伤。角鲨烯还可以有效降低致癌物质的毒性，能有效的抑制结肠癌、皮肤癌和胃癌的扩散。被广泛的应用于食品、医药和化妆品领域。

目前，角鲨烯主要来源是深海鲨鱼，而深海鲨鱼是珍贵的保护动物，生态环境破坏限制了角鲨烯的生产和使用。随着角鲨烯使用的日益广泛，天然来源角鲨烯受到资源限制。而化学合成角鲨烯的技术的复杂性和不稳定性，都无法满足庞大的市场需求。近几年来，关于利用微藻生产角鲨烯的研究逐渐增多，在所有的微藻种群中，异养型的破囊壶菌(Thraustochytrids)具有高产角鲨烯的潜力。利用破囊壶菌生产角鲨烯，具有生产周期短、所需空间小，不受地域和季节限制等独特优势。破囊壶菌作为一种极具工业化生产潜力的替代资源，已成为当前研究的热点。

但是，目前关于破囊壶菌中角鲨烯的检测方法没有系统的研究。因此，亟需一种检测破囊壶菌中角鲨烯的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种亟需解决的高效液相色谱法检测破囊壶菌中角鲨烯的方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种高效液相色谱法检测破囊壶菌中角鲨烯的方法，包括如下步骤：

(1)角鲨烯标准曲线的建立：以正己烷为溶剂，分别配制浓度为5mg/mL，1mg/mL，0.5mg/mL，0.25mg/mL，0.125mg/mL，0.0625mg/mL，0.03125mg/mL的角鲨烯标准溶液；使用高效液相色谱仪对所述溶液进行检测，以角鲨烯浓度mg/ml为横坐标，以峰面积UV.S为纵坐标，得到角鲨烯浓度与峰面积的线性回归方程；回归方程为：y＝42390x，R²＝0.9984；建立标准曲线；

(2)从破囊壶菌发酵液中提取角鲨烯：将破囊壶菌放入M4培养基中发酵培养3天，收集菌液以8000-12000r/min，离心3-5min，除去上清，用灭菌水洗2-3遍，冻干机-50℃冻干24-48h，称取冻干的菌体0.05-0.1g，加入1-1.5ml体积比为2:1的氯仿的甲醇溶液，匀质机破碎100-120s，氮吹仪吹干，加入3-5ml 15％NaOH溶液，所述NaOH溶液的溶剂为体积浓度为80％的甲醇水溶液，涡旋30-40s，60℃水浴30-90min；取出，冷却至室温，加入2ml正己烷萃取，上层萃取液为角鲨烯粗提待测样品；

(3)使用高效液相色谱对所述角鲨烯粗提待测样品进行检测，得到峰面积，代入所述回归方程，得到角鲨烯含量；