[发明专利]基于Ngpiwi蛋白介导的牛源大肠杆菌基因敲除菌株及其构建方法

权利要求书

1.一种基于Ngpiwi蛋白介导的牛源大肠杆菌基因敲除菌株的构建方法，所述牛源大肠杆菌基因敲除菌株为在牛源大肠杆菌基因组上缺失潜在毒力相关序列的缺失菌株，所述潜在毒力相关序列为潜在毒力相关基因的ORF序列或ORF的部分序列；其特征在于：包括以下步骤：

1）构建带有Ngpiwi基因的温敏自杀基础质粒pSHK5TS-NgPiwi；

a.以Natronobacterium gregoryi Piwi基因序列如SEQ ID No.2所示和ribosomebinding site片段序列如SEQ ID No.3所示为模板，设计引物对：

NgPiwi的正反向扩增引物：

NgPiwi-L：ATGACAGTGATTGACCTCGATTCG，

NgPiwi-RH-R：GCAAGAAAAAATATCAATTAGAGGAATCCGACAT；

RBS的正反向扩增引物：

RBS-RH-L：TGTCGGATTCCTCTAATTGATATTTTTTCTTGC，

RBS-R：TATGCACTCCTATTATTTAACTAAGTTGAC；

分别扩增得到NgPiwi基因片段和RBS片段；

b. 然后将NgPiwi基因片段和RBS片段进行融合，得到融合产物NgPiwi-RBS，

c.再将融合产物NgPiwi-RBS插入质粒PSHK5Ts的抗性基因Kan的启动子和编码区之间；构建得到带有NgPiwi基因的基础质粒pSHK5TS-NgPiwi；

2）构建带有NgPiwi和带有左右同源臂的待缺失的潜在毒力相关序列RR的重组质粒pSHK5TS-NgPiwi-RR-LR；

a.以待缺失的潜在毒力相关序列RR对应基因的ORF缺失部分序列及ORF序列上下游各1000bp以内的序列为模板，设计引物；所述待缺失的潜在毒力相关序列RR为牛源大肠杆菌基因组上缺失潜在毒力相关序列；

b.扩增得到待缺失的潜在毒力相关序列RR的左右同源臂即为RR-LR，通过融合PCR将左右同源臂串联成单序列，将其与基础质粒pSHK5TS-NgPiwi进行酶切、连接，PCR鉴定筛选出正确的转化子，提取转化子质粒后测序鉴定，获得带有NgPiwi基因的重组质粒pSHK5TS-NgPiwi-RR-LR；

3）牛源大肠杆菌基因敲除菌株

将pSHK5TS-NgPiwi-RR-LR用CaCl₂法转化至牛源大肠杆菌感受态中，进行PCR鉴定，筛选得到携带目的质粒的菌株；并传代培养，利用NgPiwi介导的同源重组，获得潜在毒力相关序列RR的双交换菌株；最后将上述获得的潜在毒力相关序列RR的双交换菌株无抗生素条件下进行培养，诱导质粒丢失，从而获得牛源大肠杆菌RR 基因序列敲除菌株，即为：RR 基因序列敲除的菌株ΔRR-Ecoli。

2.根据权利要求1所述基于Ngpiwi蛋白介导的牛源大肠杆菌基因敲除菌株的构建方法，其特征在于：所述步骤2）中，待缺失的潜在毒力相关序列RR选自编码精氨酸代谢途径中琥珀酰谷氨酸脱琥珀酰基因ORF序列。