[发明专利]一种紫花苜蓿耐盐基因MsPIP2；2及其应用

说明书

本发明公开了一种紫花苜蓿耐盐基因MsPIP2；2，将该紫花苜蓿耐盐基因MsPIP2；2转入到野生型拟南芥中，获得MsPIP2；2转基因植株，盐胁迫处理结果发现该紫花苜蓿耐盐基因MsPIP2；2能够提高拟南芥的耐盐能力。并通过实时定量表明该紫花苜蓿耐盐基因MsPIP2在苜蓿中也响应盐胁迫。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种紫花苜蓿耐盐基因MsPIP2；2及其应用。

背景技术

土壤盐渍化是一个世界性的难题，全世界盐渍土面积约10亿hm²，其中，中国土地盐碱化大约占到全球盐碱土面积的1/10，主要分布在东北、华北、西北内陆地区以及长江以北沿海地带，盐碱化程度普遍较高。目前盐渍化已经是影响农业发展的一个重要因素，同时也对农牧业发展产生了严重的影响。近年来，关于植物对盐逆境适应能力的研究已成为全球关注的热点。土壤盐渍化造成的后果有植被密度减小、牧草产量和质量下降。农作物在盐碱地生长发育都会有一定的影响，但牧草较农作物具有更强的耐盐性，故应在改良盐碱地时完全将牧草较强的耐盐性考虑进去，这将会极大地促进盐碱地区的畜牧业发展。

紫花苜蓿(Medicago sativa)是世界上利用最早、栽培最广的一种多年生豆科牧草。由于其产草量高、营养丰富,且具有良好的适口性，被誉为“牧草之王”，在我国畜牧业生产发展中发挥着重要的作用。此外，紫花苜蓿根系发达，并具有很强的非生物胁迫抗性并能够通过根瘤菌共生进行生物固氮等优点，对提高土壤肥力、促进粮草轮作等具有重要的意义。随着紫花苜蓿在我国大面积的栽培和集约化、商品化生产，对于优质高产高抗的新品种需求也越来越急迫。而传统的育种手段，如杂交育种、回交育种及综合品种选育等，所需时间长，并高度依赖广泛的种质资源，严重制约着苜蓿的育种进程，影响苜蓿产业的可持续发展。与传统的育种技术相比，转基因技术具有克服了有性杂交的弱点，可以在更远的亲缘关系间进行基因重组，目的性更明确，可以大大加速紫花苜蓿的育种进程。近年来，利用转基因手段进行苜蓿抗旱、抗寒等方面的研究也越来越多，为紫花苜蓿抗逆性的遗传研究提供了更大的便利，能够更快速的培育优质、高产、抗逆性强的苜蓿新品种，推动草畜业发展。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种紫花苜蓿耐盐基因MsPIP2；2，并验证其功能。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种紫花苜蓿耐盐基因MsPIP2；2，其特征在于，该紫花苜蓿耐盐基因MsPIP2；2编码区的核苷酸序列如下：

根据本发明，所述的紫花苜蓿耐盐基因MsPIP2；2编码区的氨基酸序列如下：

本发明进一步公开了该花苜蓿耐盐基因MsPIP2；2的克隆方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)苜蓿幼苗cDNA合成：

提取苜蓿幼苗总RNA，反转录得到第一链cDNA；

(2)MsPIP2；2基因全长的克隆：

以苜蓿cDNA为模板，根据NCBI上蒺藜苜蓿的PIP2；2基因序列进行同源比对并设计引物P1和引物P2，进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物，并测序得到中间片段；再根据测序得到的序列设计5’RACE引物P3和3’

RACE引物P4，进行5’端序列和3’端序列的PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物，并测序；最终将中间序列，5’端序列和3’端拼接得到MsPIP2；2基因的全长序列，并用ORF Finder找到该基因的开放阅读框ORF；其中：

引物P1序列为：5’-GATGCTGAAGAACTCACAAAAT-3’；