[发明专利]嵌合抗原受体DAP12-T2A-CD8α-MSLN scFv-NKp44及其用途

说明书

本发明公开了一种优化的嵌合抗原受体DAP12‑T2A‑CD8α‑MSLN scFv‑NKp44及其用途，所述的嵌合抗原受体由胞内第二传导结构域DAP12、T2A、CD8α信号肽、抗人MSLN单克隆抗体ss1轻链和重链可变区MSLN scFv、胞内第一传导结构域串联构成。该嵌合抗原受体用于修饰T淋巴细胞，修饰后的T细胞(CAR‑T细胞)能用于MSLN阳性的恶性实体肿瘤的治疗。在恶性实体肿瘤杀伤试验中，明显加强了CAR‑T细胞对胰腺癌肿瘤细胞的杀伤能力，在临床应用中展现出良好的安全性和抗肿瘤活性。

技术领域

本发明涉及肿瘤免疫治疗技术领域。本发明利用基因工程技术获得编码嵌合抗原受体DAP12-T2A-CD8α-MSLN scFv-NKp44的融合基因，将该基因片段插入慢病毒表达载体，包装成慢病毒，转导入人T淋巴细胞中，使T细胞表达该嵌合抗原受体。本发明还涉及编码此类跨膜多肽的核酸、载体，以及用于免疫治疗的在其表面表达所述CAR的免疫细胞。本发明所涉及的嵌合抗原受体修饰的T细胞能靶向并特异性杀伤MSLN阳性的肿瘤细胞，用于恶性实体肿瘤的治疗，开辟了对用于治疗癌症的有效的过继性免疫治疗策略的道路。

背景技术

随着肿瘤免疫学理论和临床技术的发展，嵌合抗原受体T细胞疗法(Chimericantigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T)成为目前最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一[Schmitz M，et al.Chimeric antigen receptor-engineered T cellsforimmunotherapy of Cancer.J Biomed Biotechnol，2010，doi：10.1155/2010/956304.]。嵌合抗原受体(CAR)是CAR-T的核心部件，CAR能针对所选择的免疫细胞重定向其特异性和反应性，因此赋予T细胞HLA非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相较与正常T细胞受体(TCR)应答不同，不受MHC限制，具有活化和增殖的能力，因此具有高效的杀伤肿瘤细胞的能力。

嵌合抗原受体(CAR)在T细胞上表达合成蛋白，其将抗体的抗原识别片段(如抗体单链可变区片段)与胞内信号结构域融合。研究发现，以肿瘤特异性单克隆抗体的单链可变区(scFv)取代TCR的α，β链可变区，并将scFv直接和T细胞信号传导结构域连接，形成嵌合抗原受体(CAR)表达于T细胞表面，可通过scFv识别肿瘤特异性抗原，直接产生T细胞的活化信号，促进T细胞活化、增殖，特异性杀伤肿瘤细胞。该过程主要依赖CAR-T细胞表面的scFv对肿瘤抗原的特异性识别，免疫反应的特异性和杀伤性较强。

间皮素(MSLN)是一种通过磷脂酰肌醇区(GPI)锚定在细胞膜上得糖蛋白。它最初合成的是一个69kDa的细胞表面蛋白。成熟过程中在弗林蛋白酶的作用下断裂成两段，C末端40kDa的片段锚定在膜上，N末端32kDa的片段以溶解的形式释放出来，称为巨核细胞增效因子(MPF)。MSLN在腹膜、胸膜腔和心包上的间皮细胞上表达，而在上气管、卵巢、睾丸网、扁桃体和输卵管的上皮细胞表面低表达。此外，MSLN被发现在间皮瘤、卵巢癌和肺癌等恶性肿瘤中高表达。宾夕法尼亚大学的一项研究表明，六名复发性浆液性卵巢癌患者注射表达二代CAR的MSLN CAR-T细胞治疗后，没有观察到与输注相关的急性不良事件(AE)和细胞因子释放综合症。一名患者观察到相关的3-4级AE，包括胸腔积液，呼吸急促和呼吸困难；2例患者伴有腹痛，腹水和便秘。在治疗一个月后，所有六名患者在按照RECIST标准成像时显示病情稳定(SD)[Gregory L.，et al.Activity of Mesothelin-specific Chimeric AntigenReceptor T cells Against Pancreatic Carcinoma Metastases in a Phase 1Trial.Gastroenterology,2018.]