[发明专利]SAG2基因、ROP9基因和MIC3基因重组腺病毒构建的方法及重组腺病毒和应用

权利要求书

1.一种弓形虫SAG2基因、ROP9基因和MIC3基因重组腺病毒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）从Toxoplasma gondii RH株中分别扩增出SAG2基因序列GI：M33572.1、ROP9基因序列GI：AJ401616.1和MIC3基因序列AJ132530.1；

所述的SAG2基因、ROP9基因和MIC3基因的扩增包括：以SAG2-F SEQ ID NO.1和SAG2-RSEQ ID NO.2 为引物，以RH株的RNA为模板，RT-PCR扩增获得SAG2基因；以ROP9-F SEQ IDNO.3和ROP9-R SEQ ID NO.4为引物，以RH株的RNA为模板，RT-PCR扩增获得ROP9基因；以MIC3-F SEQ ID NO.5和MIC3-R SEQ ID NO.6为引物，以RH株的RNA为模板，RT-PCR扩增获得MIC3基因；

2）将目的基因重组至腺病毒穿梭质粒，获得的重组质粒pHBAd-SAG2-ROP9-MIC3-EGFP与腺病毒大骨架质粒pBHGlox E1,3Cre共转染HEK293A细胞，重组并包装获得重组腺病毒Ad-SAG2-ROP9-MIC3-EGFP。

2.如权利要求1所述的SAG2基因、ROP9基因和MIC3基因重组腺病毒的构建方法制备的重组腺病毒。

3.如权利要求1所述的SAG2基因、ROP9基因和MIC3基因重组腺病毒的构建方法制备的重组腺病毒在制备预防弓形虫病中的药物中的应用。

4.如权利要求1所述的一种弓形虫SAG2基因、ROP9基因和MIC3基因重组腺病毒的构建方法，其特征在于所述的步骤1中，腹腔接种T. gondii RH株于Balb/c小鼠，收集的小鼠腹腔液，纯化速殖子，利用Trizol法提取虫体RNA。

5.如权利要求1所述的一种弓形虫SAG2基因、ROP9基因和MIC3基因重组腺病毒的构建方法，其特征在于所述的步骤2中，将获得的SAG2基因、ROP9基因和MIC3基因先后与穿梭载体pHBAd-EF1a-MCS-3flag-CMV-EGFP用相应的酶进行双酶切，再将其用T4连接酶16℃连接12 h，经菌液PCR、酶切及测序鉴定，筛选出正确的重组穿梭质粒pHBAd-SAG2-ROP9-MIC3-EGFP。

6.如权利要求1所述的一种弓形虫SAG2基因、ROP9基因和MIC3基因重组腺病毒的构建方法，其特征在于所述的步骤2中，取脂质体15.0 μL，并将其与3μg腺病毒穿梭质粒pHBAd-SAG2-ROP9-MIC3-EGFP和6μg腺病毒大骨架质粒pBHGloxE1,3Cre混匀，共转染HEK293A细胞，使其在HEK293A细胞中重组与包装14 d，收集CPE细胞，反复冻融并收集病毒，冻存-80℃。