[发明专利]弓形虫ROP9基因和MIC3基因重组腺病毒构建的方法及重组腺病毒和应用

说明书

本发明公开了一种弓形虫ROP9（棒状体蛋白9）基因和MIC3（微线体蛋白3）基因重组腺病毒构建的方法及重组腺病毒和应用。从Toxoplasma gondii RH株中分别扩增出ROP9基因和MIC3基因，将获得的目的基因克隆到穿梭载体pHBAd‑EF1a‑MCS‑3flag‑CMV‑EGFP中，利用脂质体转染法将重组腺病毒穿梭质粒pHBAd‑ROP9‑MIC3‑EGFP与腺病毒大骨架pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染HEK293A细胞，重组并包装获得含有ROP9基因和MIC3基因的重组腺病毒Ad‑ROP9‑MIC3‑EGFP；将此重组腺病毒免疫Balb/c小鼠后，小鼠的抗体水平得到显著提高，活化的TCL和Th淋巴细胞比例显著增高，IF‑γ、IL‑6和TN‑α等细胞因子显著增高，且对Balb/c小鼠产生一定的保护作用。

技术领域

本发明属于基因生物工程领域，涉及构建重组腺病毒的方法，具体说，是一种利用Toxoplasma gondii ROP9基因和MIC3基因重组腺病毒构建的方法及重组腺病毒和应用。

背景技术

刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是专性细胞内有核寄生的顶覆门原虫，是危害严重的食源性人兽共患寄生虫，能感染畜禽和人在内的200余种动物。人类感染率约为25％～50％，全球约有5～10亿人感染弓形虫病；弓形虫致死性爆发可造成畜禽大量死亡，猪爆发弓形虫病时，死亡率达60％。弓形虫不仅直接危害畜牧业的发展和产品质量安全，而且可因肉食品安全而引发公共卫生和生物恐慌事件，影响社会稳定。

目前，弓形虫的常规疫苗种类包括灭活疫苗、减毒活疫苗、虫体特异组分疫苗和重组蛋白疫苗。但还没有可用于人的弓形虫疫苗，部分国家使用的兽用弓形虫疫苗也仅有一种：S48弱毒株疫苗。因此，研发新型疫苗是控制弓形虫感染和传播的迫切需求。基因工程苗同时具备弱毒疫苗和灭活疫苗的优点，尤其多价基因工程疫苗对控制疫病的传播更具优势。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种ROP9基因和MIC3基因重组腺病毒构建的方法及重组腺病毒和应用，将T.gondii的入侵相关蛋白的基因ROP9和MIC3与腺病毒载体系统高效稳定表达外源基因的特性结合起来，构建出能够表达上述蛋白质的重组腺病毒，分别检测免疫鼠后机体内产生的抗T.gondii抗体的水平、淋巴细胞比例和细胞因子变化等指标，并通过免疫攻虫保护试验检测其免疫保护效果，评价研制的预防弓形虫病的二价基因工程活载体疫苗。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种ROP9基因和MIC3基因构建重组腺病毒的方法，包括以下步骤：

1)从T.gondii RH株中分别扩增出ROP9基因序列GI：AJ401616.1和MIC3基因序列GI：AJ132530.1；

所述的ROP9基因和MIC3基因的扩增包括：以ROP9-F SEQ ID NO.1和ROP9-R SEQID NO.2为引物，以RH株的RNA为模板，RT-PCR扩增获得ROP9基因；以MIC3-F SEQ ID NO.3和MIC3-R SEQ ID NO.4为引物，以RH株的RNA为模板，RT-PCR扩增获得MIC3基因；

2)将目的基因重组至腺病毒穿梭质粒，获得的重组质粒pHBAd-ROP9-MIC3-EGFP与腺病毒大骨架质粒pBHGlox E1,3Cre共转染HEK293A细胞，重组并包装获得重组腺病毒Ad-ROP9-MIC3-EGFP。

所述的T.gondii ROP9基因和MIC3基因重组腺病毒的构建方法制备的重组腺病毒。

所述的T.gondii ROP9基因和MIC3基因重组腺病毒的构建方法制备的重组腺病毒在预防弓形虫中的应用。