[发明专利]一种鉴定肾癌生物标记物的方法及其检测试剂盒

说明书

本发明提供了一种鉴定肾癌的生物标记物的方法及其检测试剂盒。所述生物标记物为血清中经过柱前1‑苯基‑5‑甲基吡唑啉酮(PMP)衍生的高效液相色谱得到的游离甘露糖和葡萄糖与甘露糖浓度的比值。本发明检测方法为柱前PMP衍生的高效液相色谱法。本发明的技术方案具有前处理简单，分析时间短，仪器价格合理，符合常规使用，操作步骤简单易学，检测结果准确性高，只需采血便可区分正常人和肾癌患者，并且所需血清量极少，采血量小于1mL等优点。所得结果显示此分析方法可以快速定量肾癌患者血清中游离的甘露糖和葡萄糖，对于研究血清游离甘露糖及葡萄糖与肾癌之间的关系、寻找新型肾癌临床检测标志物有着非常重要的意义。

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种鉴定肾癌的生物标记物的方法及其检测试剂盒。

背景技术

肾脏是泌尿系统一个重要的器官，主要功能是生成和排泄尿液，并以此排泄人体代谢废物，对维持机体内环境的稳定起重要作用；另外，肾脏也是一个内分泌器官，主要调节血压、红细胞生成和骨骼生长等。因此，肾脏产生疾病对人体的机能产生很大影响。肾脏疾病的诊断一般需要进行尿液检查、血液检查、影像学检查和病理学检查，并结合临床表现来进行诊断。这些诊断方法均会带来一定的弊端。例如，影像学检查对肾癌诊断的准确率高达90％以上，但是影像学检查会有辐射，会对人体会产生影响。另外，目前，还没有公认的可用于临床诊断肾癌的肿瘤生物标志物。肾癌的临床诊断主要依靠影像学检查，确诊则需要肾活检的病理学检查。因此，寻找一种方便，无创伤或微创的诊断和预后监测方法对病人的状况实时监测，制定个体化的治疗方案是十分必要的。而最理想的早期检测就是不需活检，且灵敏性和特异性高的血清分析。

人体血清游离单糖中葡萄糖的含量最高，正常人的范围为3.90～6.16mmol/L。目前，医院检验科可以直接通过测生化指标检测葡萄糖浓度，暂时不可以直接检测甘露糖浓度。健康成人血浆中游离甘露糖的浓度范围为20～80μmol/L。甘露糖的含量约为葡萄糖含量的1％。它大部分被认为是由细胞中的葡萄糖异构化而来。而近来有研究表明，细胞中流出的游离的甘露糖是哺乳动物血液中游离甘露糖的主要来源。这两部分来源的游离甘露糖维持着血清中甘露糖的稳定。D-甘露糖是糖蛋白，细胞表面糖缀合物和糖基化磷脂酰肌醇锚定蛋白等结构中必需的单糖。其中，甘露糖是各种多糖复合物中N-糖链的重要组分，N-聚糖中的甘露糖残基来源于血液中的葡萄糖或甘露糖。游离甘露糖是正常的血浆成分。目前，血清甘露糖的测定方法主要有酶法、气液色谱法、高分辨液相层析、气液色谱-质谱法和毛细管电泳法等。但这些方法均存在一定的不足之处。比如，使用酶法、气液色谱法和高分辨液相层析时，为避免高浓度的葡萄糖的影响需要将其去除，致使前处理过程比较繁琐；气液色谱-质谱法仪器价格昂贵，不适合常规目的；所需血清样本量大。目前没有文献报道柱前1-苯基-5-甲基吡唑啉酮(PMP)衍生的高效液相色谱法同时检测肾癌患者血清中游离的甘露糖和葡萄糖。

发明内容

本发明的目的是提供用于鉴定肾癌的生物标记物及其应用，本发明采用柱前PMP衍生的高效液相色谱法(HPLC)检测肾癌患者血清中的单糖，尤其涉及血清中游离甘露糖和葡萄糖的检测。本发明的技术方案可以用于检测肾癌患者或正常人血清游离甘露糖和葡萄糖浓度，可以用于鉴定肾癌患者。

为实现本发明的目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

用于鉴定肾癌的生物标记物，所述生物标记物为血清经过柱前PMP衍生的高效液相色谱得到的游离甘露糖和和葡萄糖与甘露糖浓度的比值(G/M浓度比)。

用于鉴定肾癌的生物标记物的定量分析方法，其特征在于：该方法为柱前PMP衍生的高效液相色谱法，包括以下具体步骤：

(1)调节pH为7-14：取待检测的血清样品加超纯水于EP管中，加入氢氧化钠，涡旋混匀；

(2)PMP衍生：每个样品加入PMP，涡旋混匀，离心后置于烘箱反应；

(3)加酸中和反应：将烘箱内的样品取出，放置冷却，每个样品加入盐酸，涡旋混匀；