[发明专利]一种鉴定白血病生物标记物的方法及其检测试剂盒

说明书

本发明提供了一种鉴定白血病的生物标记物的方法及其检测试剂盒。所述生物标记物为血清中经过柱前1‑苯基‑5‑甲基吡唑啉酮(PMP)衍生的高效液相色谱得到的游离甘露糖和葡萄糖。本发明检测方法为柱前PMP衍生的高效液相色谱法。本发明的技术方案具有前处理简单，分析时间短，仪器价格合理，符合常规使用，操作步骤简单易学，检测结果准确性高，只需采血便可区分正常人和白血病患者，并且所需血清量极少，采血量小于1mL等优点。所得结果显示此分析方法可以快速定量白血病患者血清中游离的甘露糖和葡萄糖，对于研究血清游离甘露糖及葡萄糖与白血病之间的关系、寻找新型白血病临床检测标志物有着非常重要的意义。

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种鉴定白血病的生物标记物的方法及其检测试剂盒。

背景技术

白血病是一类造血干祖细胞的恶性克隆性疾病，因白血病细胞自我更新增强、增殖失控、分化障碍、凋亡受阻，而停滞在细胞发育的不同阶段。在骨髓及其他造血组织中，白血病细胞大量增生累积，使正常造血抑制并浸润其他器官组织。

白血病的主要临床相关辅助检查为血象和骨髓象检查、细胞化学检查、免疫学检查、染色体及分子生物学检查、血液生化检查。但临床上确诊白血病首选的检查方法仍是骨髓象检查。但骨髓象检查会形成较大的伤口，且非常疼痛，对患者的身心均造成很大的伤害。因此，寻找一种相对无痛、方便且无创的检测方法十分必要。最理想的早期检测方法就是不需要进行骨髓象检查的血液分析检查。

人体血清游离单糖中葡萄糖的含量最高，正常人的范围为3.90～6.16mmol/L。目前，医院检验科可以直接通过测生化指标检测葡萄糖浓度，暂时不可以直接检测甘露糖浓度。健康成人血浆中游离甘露糖的浓度范围为20～80μmol/L。甘露糖的含量约为葡萄糖含量的1％。它大部分被认为是由细胞中的葡萄糖异构化而来。而近来有研究表明，细胞中流出的游离的甘露糖是哺乳动物血液中游离甘露糖的主要来源。这两部分来源的游离甘露糖维持着血清中甘露糖的稳定。D-甘露糖是糖蛋白，细胞表面糖缀合物和糖基化磷脂酰肌醇锚定蛋白等结构中必需的单糖。其中，甘露糖是各种多糖复合物中N-糖链的重要组分，N-聚糖中的甘露糖残基来源于血液中的葡萄糖或甘露糖。游离甘露糖是正常的血浆成分。目前，血清甘露糖的测定方法主要有酶法、气液色谱法、高分辨液相层析、气液色谱-质谱法和毛细管电泳法等。但这些方法均存在一定的不足之处。比如，使用酶法、气液色谱法和高分辨液相层析时，为避免高浓度的葡萄糖的影响需要将其去除，致使前处理过程比较繁琐；气液色谱-质谱法仪器价格昂贵，不适合常规目的；所需血清样本量大。目前没有文献报道柱前1-苯基-5-甲基吡唑啉酮(PMP)衍生的高效液相色谱法同时检测白血病患者血清中游离的甘露糖和葡萄糖。

发明内容

本发明的目的是提供了用于鉴定白血病的生物标记物及其应用，本发明采用柱前PMP衍生的高效液相色谱法(HPLC)检测白血病患者血清中的单糖，尤其涉及血清中游离甘露糖和葡萄糖的检测。本发明的技术方案可以用于检测白血病患者或正常人血清游离甘露糖和葡萄糖浓度，可以用于鉴定白血病患者。

为实现本发明的目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

用于鉴定白血病的生物标记物，所述生物标记物为血清经过柱前PMP衍生的高效液相色谱得到的游离甘露糖和葡萄糖。

用于鉴定白血病的生物标记物的定量分析方法，其特征在于：该方法为柱前PMP衍生的高效液相色谱法，包括以下具体步骤：

(1)调节pH为7-14：取待检测的血清样品加超纯水于EP管中，加入氢氧化钠，涡旋混匀；

(2)PMP衍生：每个样品加入PMP，涡旋混匀，离心后置于烘箱反应；

(3)加酸中和反应：将烘箱内的样品取出，放置冷却，每个样品加入盐酸，涡旋混匀；

(4)萃取：每管加入有机溶剂，涡旋，离心，移除下层有机溶剂，保留上清；