[发明专利]一种鉴定结直肠癌症生物标记物的方法及其检测试剂盒

说明书

本发明提供了一种鉴定结直肠癌的生物标记物的方法及其检测试剂盒。所述生物标记物为血清中经过柱前1‑苯基‑5‑甲基吡唑啉酮(PMP)衍生的高效液相色谱得到的游离甘露糖和葡萄糖。本发明检测方法为柱前PMP衍生的高效液相色谱法。本发明的技术方案具有前处理简单，分析时间短，仪器价格合理，符合常规使用，操作步骤简单易学，检测结果准确性高，只需采血便可区分正常人和结直肠癌患者，并且所需血清量极少，采血量小于1mL等优点。所得结果显示此分析方法可以快速定量结直肠癌患者血清中游离的甘露糖和葡萄糖，对于研究血清游离甘露糖及葡萄糖与结直肠癌之间的关系、寻找新型结直肠癌临床检测标志物有着非常重要的意义。

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种鉴定结直肠癌的生物标记物的方法及其检测试剂盒。

背景技术

结直肠癌(CRC)是世界上第三种常见的恶性肿瘤，也是第二大导致癌症死亡的原因。据估计，2012年全球约有140万新发病例和70万死亡病例。早期患者手术后的5年生存率超过90％，但是目前由于大多数患者缺乏明显的临床症状发现时已是晚期导致死亡率增加。目前临床上使用较为广泛的诊断方法包括：结肠镜检查，超声检查，计算机断层扫描(CT)， MRI，粪便隐血试验(FOBT)，CEA，CA19-9等传统血清学生物标志物。结肠镜检查作为结直肠癌诊断的标准检测方法，具有高灵敏度和特异性，能够检测并且切除病变，甚至在癌前病变中也是如此，但由于它是侵入性检查常常会给患者带来不适感而且它的准确性还受医生的手术技能经验和患者依从性的影响。超声、CT、MRI可以用于肿瘤的检查，但当发现肿块时仍需通过结肠镜检查确诊。粪便隐血试验(FOBT)可作为广谱筛查试验使用，但其灵敏度差的特点阻碍了在临床实践中的广泛应用。而血液分析是非侵入性的，可以最大限度地降低患者的风险且容易操作可以多次重复以降低诊断错误率，但传统的血清生物血标志物的诊断性能不好不能在早期发现诊断结直肠癌，因此寻找一种新型的高灵敏度和特异性的标志物十分重要。

血清中还原性单糖似乎仅限于甘露糖和葡萄。人体血清游离单糖中葡萄糖的含量最高，正常人的范围为3.90～6.16mmol/L。目前，医院检验科可以直接通过测生化指标检测葡萄糖浓度，暂时不可以直接检测甘露糖浓度。健康成人血浆中游离甘露糖的浓度范围为20～80 μmol/L。甘露糖的含量约为葡萄糖含量的1％。它大部分被认为是由细胞中的葡萄糖异构化而来。而近来有研究表明，细胞中流出的游离的甘露糖是哺乳动物血液中游离甘露糖的主要来源。这两部分来源的游离甘露糖维持着血清中甘露糖的稳定。D-甘露糖是糖蛋白，细胞表面糖缀合物和糖基化磷脂酰肌醇锚定蛋白等结构中必需的单糖。其中，甘露糖是各种多糖复合物中N-糖链的重要组分，N-聚糖中的甘露糖残基来源于血液中的葡萄糖或甘露糖。游离甘露糖是正常的血浆成分。目前，血清甘露糖的测定方法主要有酶法、气液色谱法、高分辨液相层析、气液色谱-质谱法和毛细管电泳法等。但这些方法均存在一定的不足之处。比如，使用酶法、气液色谱法和高分辨液相层析时，为避免高浓度的葡萄糖的影响需要将其去除，致使前处理过程比较繁琐；气液色谱-质谱法仪器价格昂贵，不适合常规目的；所需血清样本量大。

发明内容

本发明的目的是提供了用于鉴定结直肠癌的生物标记物及其应用，本发明采用柱前PMP 衍生的高效液相色谱法(HPLC)检测结直肠癌患者血清中的单糖，尤其涉及血清中游离甘露糖和葡萄糖的检测。本发明的技术方案可以用于检测结直肠癌患者或正常人血清游离甘露糖和葡萄糖浓度，可以用于鉴定结直肠癌患者。

为实现本发明的目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

用于鉴定结直肠癌的生物标记物，所述生物标记物为血清经过柱前PMP衍生的高效液相色谱得到的游离甘露糖和葡萄糖。

用于鉴定结直肠癌的生物标记物的定量分析方法，其特征在于：该方法为柱前PMP衍生的高效液相色谱法，包括以下具体步骤：

(1)调节pH为7-14：取待检测的血清样品加超纯水于EP管中，加入氢氧化钠，涡旋混匀；