[发明专利]一种含羧基香豆素衍生物及其合成方法和应用

权利要求书

1.一种含羧基香豆素衍生物XI-2，其特征在于，结构式为：

。

2.如权利要求1所述的一种含羧基香豆素衍生物XI-2的合成方法，其特征在于，步骤如下：

1）将氯甲酸乙酯和碳酸氢钠溶解在四氢呋喃中，缓慢滴加到含间羟基苯基哌嗪的四氢呋喃和去离子水的混合溶液中，室温过夜搅拌；萃取，干燥，减压蒸馏得到白色针状晶体化合物A：4-（3-羟基苯基）哌嗪-1-甲酸乙酯；其中氯甲酸乙酯、碳酸氢钠和间羟基苯基哌嗪的摩尔比1.4-1.7:1.1-1.4:1；

2）在冰水浴条件下，将过量的三氯氧磷缓慢滴加到N,N-二甲基甲酰胺中，搅拌，将0℃溶解在N,N-二甲基甲酰胺中的化合物A加入到上述溶液中，搅拌；将体系倒入冰水中，调pH至析出大量白色固体，抽滤，得化合物B：4-（4-甲酰基-3-羟基苯基）哌嗪-1-甲酸乙酯；

3）按摩尔比1:1.5-2.0将步骤2）所得化合物B和乙酰乙酸乙酯加入乙醇中，加入催化量的哌啶，回流至反应完全；冷却至室温，析出黄色针状固体，抽滤得化合物C：4-（3-乙酰基-2-氧代-2H-色烯-7-基）哌嗪-1-甲酸乙酯；

4）按摩尔比1:1.5-2.0将步骤3）所得化合物C和对苯二甲醛溶解在乙醇中，加入催化量的哌啶，回流至反应完全；冷却，析出黄色固体，抽滤得黄色粉末状固体，经柱色谱分离得化合物D：（E）-4-（3-（3-（4-甲酰基苯基）丙烯酰基）-2-氧代-2H-色烯-7-基）哌嗪-1-甲酸乙酯；

5）按摩尔比1:2.5-3.5将步骤4）所得化合物D和2-氰基乙酸溶于乙醇中，加入催化量的哌啶，回流至反应完全；体系减压蒸干溶剂得到粗产品，经柱色谱分离，纯化得目标化合物XI-2。

3.如权利要求2所述的含羧基香豆素衍生物XI-2的合成方法，其特征在于，所述步骤1）中四氢呋喃和去离子水体积比为1:1；所述的氯甲酸乙酯、碳酸氢钠和间羟基苯基哌嗪的摩尔比为1.5:1.25:1。

4.如权利要求2所述的含羧基香豆素衍生物XI-2的合成方法，其特征在于，所述步骤4）中C和对苯二甲醛的摩尔比为1：1.5，柱色谱的洗脱剂为二氯甲烷与乙酸乙酯的体积比为15:1

5.如权利要求2所述的含羧基香豆素衍生物XI-2的制备方法，其特征在于，所述步骤5）中化合物D和2-氰基乙酸的摩尔比优选为1：3，柱色谱的洗脱剂为二氯甲烷与甲醇的体积比为10:1。

6.一种特异性检测半胱氨酸的方法，包括如下步骤：

（1）、配制pH=7.4、浓度为10 mM的PBS缓冲溶液，配制20 mM的半胱氨酸水溶液，配置2mM的如权利要求1所述的XI-2的DMSO溶液；

（2）、取2 mL体积比为4:1的 pH 7.4的PBS和DMSO的混合溶液到一个荧光比色皿中，10µL XI-2的DMSO溶液加入到上述体系中，在荧光分光光度仪上检测，随着待测样半胱氨酸的加入, 500 nm处的荧光强度的逐渐增强；

（3）、在6个比色皿中，各加入2 mL体积比为4:1的 pH 7.4的PBS和DMSO的混合溶液，分别加入半胱氨酸溶液的体积为0、2、4、6、8、10 µL，5 min后在荧光光谱仪上测定500 nm处荧光强度为50.46、285.0、555.4、845.7、1087、1321，以半胱胺酸浓度为横坐标，以荧光强度为纵坐标绘制图，得到半胱氨酸浓度的工作曲线；线性回归方程为：F =12.92 c + 44.92667，c的单位为10^-6 mol/L；

(4)、测定样品溶液时，将测得的荧光强度代入线性回归方程，即可求得半胱氨酸的浓度。

7.如权利要求1所述的含羧基香豆素衍生物XI-2在制备体外循环检测半胱氨酸试剂中的应用。

8.如权利要求1所述的含羧基香豆素衍生物XI-2在制备细胞半胱氨酸检测试剂中的应用。