[发明专利]一种青霉素酰化酶的固定化方法及固定化酶

说明书

本发明提供了一种青霉素酰化酶的固定化方法，属于酶的固定化技术领域，所述方法包括以下步骤：1)将桥接体溶液滴加到载体溶液中，进行第一缩合反应2～5h后，进行第一固液分离，收集固相组分，获得带桥接体的载体；2)将步骤1)获得的带桥接体的载体与青霉素酰化酶水溶液混合搅拌得到混合料液，向所述混合料液中滴加三乙氨进行第二缩合反应20～40h后，进行第二固液分离，收集固相组分为固定化的青霉素酰化酶；所述桥接体为主链包含2～8个碳原子的卤酰卤；所述载体为氨基树脂。本发明所述方法制备获得的青霉素酰化酶酶活性高，稳定性好。

技术领域

本发明属于酶的固定化技术领域，尤其涉及一种青霉素酰化酶的固定化方法及固定化酶。

背景技术

固定化酶是20世纪60年代发展起来的一种新技术，所谓固定化酶，是指在一定的空间范围内起催化作用，并能反复和连续使用的酶。酶法生产6-氨基青霉烷酸(6-Aminopenicillanic acid,6-APA)工艺的核心问题是高效固定化青霉素酰化酶(Penicillin G acylase,PGA)的制备技术，而载体与PGA能否特异、高效、牢固链接是固定化技术的关键所在。

现有的固定化酶的方法主要有吸附法、包埋法、交联法和共价结合法。吸附法是最早出现的固定化方法，吸附法又可以分为两种，分别是离子交换吸附和物理吸附。吸附法条件比较温和，不会很大程度地改变酶的构象，因此对酶的催化性能不会产生大的影响；但是酶和载体之间的结合力较弱，在一些特殊的条件下，比如高盐浓度、高温等条件下，酶就很容易从载体上脱落并且污染催化反应产物。包埋法是将酶包埋于聚合物的孔隙中的固定化方法。根据包埋形态类型可将包埋法分为网格型和微囊型两种。利用聚丙烯酰胺、聚乙妇醇、淀粉、明胶、海藻酸等载体的细微网格将酶包埋进去的方法称为网格型包埋。微囊型是指将酶包埋于高分子半透膜中形成微胶囊。包埋法容易出现酶的漏失和扩散限制等问题。交联法指的是利用一些多功能交联试剂，如戊二醛等，在酶分子间或酶分子和载体分子间形成共价键，在不同的交联条件下，生产固定化酶。但是采用交联剂戊二醛等形成的共价亚胺键很容易遇水断裂，酶容易从载体上脱落、流失。共价结合法是通过载体表面的活性功能基团和酶分子上的非必需基团形成化学共价键，从而实现不可逆结合的酶固定方法。现有技术采用环氧树脂、1,3二卤代烷烃，1,4二卤代烷烃，1,5二卤代烷烃，实现载体与酶的共价结合；存在的缺点是：1、采用环氧树脂由于环氧基的亲电活性不高，反应条件比较激烈，容易造成酶的失活；2、采用双取代卤代烷烃作为桥接体连接酶和载体时，由于作为桥接体的卤代烷烃两端的碳的亲电活性相同，很容易造成卤代烷烃两端的碳都和载体或酶结合，无法实现载体和酶之间的连接。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种青霉素酰化酶的固定化方法及固定化酶，所述固定化方法能够有效实现载体和酶之间的连接，且连接条件温和，不易造成酶的失活，获得的固定化酶稳定性好。

为了实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：

一种青霉素酰化酶的固定化方法，包括以下步骤：

1)将桥接体溶液滴加到载体溶液中，进行第一缩合反应2～5h后，进行第一固液分离，收集固相组分，获得带桥接体的载体；

2)将步骤1)获得的带桥接体的载体与青霉素酰化酶水溶液混合搅拌得到混合料液，向所述混合料液中滴加三乙氨进行第二缩合反应20～40h后，进行第二固液分离，收集固相组分为固定化的青霉素酰化酶；

所述桥接体为主链包含2～8个碳原子的卤酰卤；

所述载体为氨基树脂。

优选的，所述桥接体为卤乙酰卤、卤丙酰卤、卤丁酰卤或卤戊酰卤。

优选的，步骤1)中所述滴加的时间为20～60min，所述滴加和第一缩合反应的温度独立为-10～40℃。

优选的，所述桥接体与载体的质量比为(0.05～0.2)：1。