[发明专利]一种具有农药降解活性的植物乳杆菌、其制备方法及应用

权利要求书

1.一株具有农药降解活性的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)P9，该菌株已于2018年8月30日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCCNo.16401。

2.根据权利要求1所述的植物乳杆菌P9，其特征在于所述农药包括氧化乐果、甲拌磷和乐果。

3.权利要求1的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)P9的制备方法，其特征在于该方法包括下述步骤：

A、菌株活化培养

取酸粥样品，将所述酸粥样品按照10^-4、10^-5、10^-6梯度稀释后涂布于含有0.1wt％放线菌酮和0.1wt％硫酸粘菌素的MRS培养基平板或者M17培养基平板上，30℃厌氧培养48h～72h，然后挑取单菌落转接于TPY增菌培养液中，30℃培养24h～48h，再划线接种于MRS琼脂培养基中，30℃培养24h～48h，观察记录菌落形态和革兰氏染色细胞形态特征，并进行过氧化氢酶试验；挑选革兰氏染色阳性、过氧化氢酶试验阴性的菌株作为待试菌株，分别接种于MRS液体培养基中，37℃培养24h～48h后，做进一步鉴定；

B、分子生物学鉴定

取步骤A的待试菌株分别接种于TPY增菌液体培养基中，30℃恒温培养24h，传代培养2～3代后，取2mL对数生长末期的菌体培养物置于无菌EP管内，4℃下8000×g离心3min收集菌体，弃上清，采用乳酸菌专用CTAB冻融法提取菌株的基因组DNA；

以菌体DNA为扩增模板，采用通用引物PCR扩增16SrRNA基因区域，扩增产物经纯化后进行16SrRNA基因序列测定，然后通过基因序列比对和系统发育关系研究进行种属鉴定，待试菌株鉴定为植物乳杆菌(L.plantarum)；

C、气相色谱质谱联用仪(GC-MS)测定植物乳杆菌对氧化乐果、甲拌磷和乐果的降解率

(1)待试菌株接种到MRS培养基中活化，连续转接三次，每次37℃培养24h培养，活化三代的待试菌株以接种量1×107cfu/mL接种到含0.5mg/kg氧化乐果、0.5mg/kg甲拌磷和0.5mg/kg乐果的MRS培养基中，37℃培养24h，取发酵液以4000×g离心10min，上清液经0.22μm微膜过滤得到滤液，-20℃冰箱保存备用；

(2)取20g步骤(1)的滤液，置于50mL离心管中，加入15mL的丙酮-乙腈(1：4，v/v)混合液，轻轻摇动均匀，静置20min；然后摇动30s后3600rpm离心5min，然后上层液体转移到分液漏斗中；向上述分液漏斗中添加25mL的二氯甲烷，震荡10min充分混匀，静置10min；将分液漏斗中的下层液体放出到烧杯中，添加1g无水Na₂SO₄干燥20min；干燥后的提取液经滤纸过滤后定容至50mL；取上述定容后的提取液过0.22μm的滤膜上气相-质谱联用仪分别测定氧化乐果、甲拌磷和乐果浓度；

计算农药降解率，农药降解率计算公式：

降解率(％)＝(C₀-C₁)/C₀×100％

C₀——MRS空白组农药浓度；C₁——MRS乳酸菌发酵后的残留浓度；

(3)挑选对三种有机磷农药都具有较好降解效果的待试菌株作进一步测试；

D、测定待试菌株的胃肠液耐受性和胆盐耐受性

获得一株胃肠液耐受性高、胆盐耐受性高、对氧化乐果和乐果的降解率>9％且对甲拌磷降解率>28％的菌株命名为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)P9。

4.权利要求1-3所述的具有农药降解活性的植物乳杆菌P9在食品或食品添加剂中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述食品是发酵食品或菌剂。

6.权利要求1-3所述的具有农药降解活性的植物乳杆菌P9在抗甜瓜疫霉菌中的应用。