[发明专利]一株敲除fimA基因的重组大肠杆菌及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一株敲除fimA基因的重组大肠杆菌，该大肠杆菌中的fimA基因失活，本发明还公开了该敲除fimA基因的重组大肠杆菌的构建方法，实验结果表明发酵产敲除大肠杆菌中fimA基因，对大肠杆菌发酵产L‑苏氨酸有一定的促进作用，在增加L‑苏氨酸的产量的同时可以缩短发酵周期。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一株敲除fimA基因的重组大肠杆菌及其构建方法与应用。

背景技术

L-苏氨酸是由W.C.Rose在1935年从纤维蛋白水解产物中分离和鉴定出来的一种氨基酸，它是人体和动物所需的八种氨基酸中仅次于蛋氨酸、赖氨酸和色氨酸的第四种必需氨基酸。由于人体自身不能合成,必须从食物中摄取,L-苏氨酸作为食品添加剂广泛应用于食品、饲料和医疗方面。最近几年，由于L-苏氨酸的作用十分广泛，国际市场对苏氨酸的需求高速增长，而未来苏氨酸的市场仍将快速增加，苏氨酸已成为需求量增长最快的氨基酸品类之一。

目前L-苏氨酸的生产方法主要有微生物发酵法、蛋白质水解法、化学合成法3种，而现在微生物发酵法占有主流生产方法，具有节约资源，成本低，环境污染小等优点，已经广泛应用于工业生产中。随着生物科学技术的不断创新，工业微生物菌种广泛应用与各种生产中，特别是工业微生物载体系统的构建，为优良的L-苏氨酸生产菌株的筛选和产酸水平的提高提供可靠的技术保障，使微生物直接发酵法生产L-苏氨酸成为一种最优最佳的工业化生产方法。大肠杆菌产苏氨酸现在普遍运用到微生物发酵实验中，其优点是菌种繁殖快，发酵周期短，成本低等特点，但相对于氨基酸行业的需求，虽然产量稳定增加，但是速度还是比较慢。因此基因工程菌高产氨基酸的改造成为生产应用中的重中之重。

大肠杆菌Ⅰ型菌毛由fim操纵子编码，包括fimA-fimH。本发明选择fimA基因进行分子研究，fimA基因是Ⅰ型菌毛的结构基因，由fimA基因编码的亚单位FimA是构成Ⅰ型菌毛的主要结构蛋白，约占Ⅰ型菌毛总蛋白的95％以上。也是大肠杆菌生物膜的关键基因和毒力因子。

发明内容

本发明要解决的问题是，提供一株敲除fimA基因的重组大肠杆菌，以提高大肠杆菌发酵制备L-苏氨酸的产量。

本发明还要解决的问题是，提供上述敲除fimA基因的重组大肠杆菌的构建方法。

本发明最后要解决的问题是，提供上述敲除fimA基因的重组大肠杆菌在发酵制备L-苏氨酸中的应用。

为解决上述问题，本发明提供如下技术方案：

一株敲除fimA基因的重组大肠杆菌，该大肠杆菌中的fimA基因失活，所述的失活是指在该菌株中fimA基因失去编码得到正常蛋白质的功能，本发明实施中将大肠杆菌中fimA基因被卡那霉素抗性基因替换，但选用其他基因替换fimA基因，或者在fimA基因中插入其他基因片段均可以使fimA基因失活，所述fimA基因序列如SEQ ID NO：4所示。

其中，所述大肠杆菌为CIBTS1688，大肠杆菌CIBTS1688赠自中国科学院上海生命科学研究院，所述大肠杆菌CIBTS1688已于中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏编号为CCTCC NO:M 2015233，菌株号为CIBTS1688，其具体信息已在申请号为201510199036.1的发明专利中公开，

其中，所述大肠杆菌的fimA基因被卡那霉素抗性基因替换，替换后在大肠杆菌的基因组上原fimA基因被卡那霉素抗性基因替换。

上述敲除fimA基因的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将质粒PKD46(其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示)电转入大肠杆菌CIBTS1688中，筛选出带有PKD46质粒的重组菌，培养重组菌，用L-阿拉伯糖诱导，再将L-阿拉伯糖诱导后的重组菌细胞制备成感受态细胞；