[发明专利]一种表达制备蔗糖磷酸化酶的方法有效
申请号: | 201811331391.X | 申请日: | 2018-11-09 |
公开(公告)号: | CN109306357B | 公开(公告)日: | 2021-12-17 |
发明(设计)人: | 李拖平;李苏红;佟超男;孙玥 | 申请(专利权)人: | 沈阳农业大学 |
主分类号: | C12N15/75 | 分类号: | C12N15/75;C12N1/21;C12N9/10;C12R1/125 |
代理公司: | 沈阳杰克知识产权代理有限公司 21207 | 代理人: | 金春华 |
地址: | 110866 辽*** | 国省代码: | 辽宁;21 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 表达 制备 蔗糖 磷酸化酶 方法 | ||
本发明涉及一种高效制备蔗糖磷酸化酶的方法。是将蔗糖磷酸化酶SP基因与枯草芽孢杆菌用载体构建重组表达载体。然后将重组表达载体转化至枯草芽孢杆菌中构建重组工程菌。将重组工程菌在液体培养基中诱导培养,菌液离心,取上清液。本发明的方法蔗糖磷酸化酶产量高,蛋白较纯净,回收纯化容易,生产操作简单,为SP的工业化大规模生产提供了便利,提高了产量,省时省力,节约成本。尤其是对该酶在食品工业中的应用提供了安全保障,具有重大意义。
技术领域
本发明涉及一种能高效表达蔗糖磷酸化酶的重组工程菌以及用改进高效表达制备蔗糖磷酸化酶的方法,属于基因工程技术领域。
背景技术
蔗糖磷酸化酶(EC2.4.1.7,Sucrose phosphorylase,SPase)属于糖基水解酶第13家族,是催化转移葡萄糖苷键的特异性酶,能够可逆地催化蔗糖发生磷酸解作用,生成1-磷酸葡萄糖和D-果糖。该酶具有广泛的底物特异性,在食品、化妆品等工业生产中具有重要的应用价值。然而现有技术中,蔗糖磷酸化酶在野生菌中提取时的产率很低,分离精制困难,不适合大批量的制备。有通过大肠杆菌表达蔗糖磷酸化酶的,但在大肠杆菌中是胞内表达,易形成包涵体,同时,酶蛋白的获取需要对细胞进行破碎处理,杂蛋白含量高,分离精制困难,操作繁琐耗时,蛋白表达量也不高。
发明内容
为了解决上述技术问题,本发明的目的之一是采用基因工程技术构建一种高效表达蔗糖磷酸化酶的重组表达载体及重组工程菌。
本发明的目的之二是提供一种产量高,蛋白较纯净,回收纯化容易,无内毒素、生产操作简单的利用重组工程菌生产蔗糖磷酸化酶的方法。
本发明采用的技术方案是:一种高效表达蔗糖磷酸化酶的重组表达载体,所述的重组表达载体是将蔗糖磷酸化酶(SP)基因与表达载体连接,构建的重组表达载体;所述的表达载体是枯草芽孢杆菌用载体或大肠杆菌-枯草芽孢杆菌用穿梭载体。
进一步的,上述的高效表达蔗糖磷酸化酶的重组表达载体,所述的表达载体是pHT系列载体、穿梭载体pMA5或穿梭载体pWB980等。但不限于这些载体,所有枯草芽孢杆菌用载体或大肠杆菌-枯草芽孢杆菌用穿梭载体均可使用。
更进一步的,上述的高效表达蔗糖磷酸化酶的重组表达载体,所述的pHT系列载体是pHT43、pHT304或pHT01载体。
进一步的,上述的高效表达蔗糖磷酸化酶的重组表达载体,所述的表达载体中含有或不含有蛋白纯化标签。
更进一步的,上述的高效表达蔗糖磷酸化酶的重组表达载体,所述的蛋白纯化标签是组氨酸(His-tag)标签。
一种高效表达蔗糖磷酸化酶的重组工程菌,是将上述的高效表达蔗糖磷酸化酶的重组表达载体转化至宿主菌中构建的重组工程菌;所述的宿主菌是枯草芽孢杆菌。
进一步的,上述的一种高效表达蔗糖磷酸化酶的重组工程菌,所述的转化为电转化。
一种高效表达制备蔗糖磷酸化酶的方法。方法如下:将上述的高效表达蔗糖磷酸化酶的重组工程菌以1-10%的接种量接种于液体培养基中,于60-200rpm培养至OD600=0.3-1.0时,加入IPTG至终浓度为0.1-1.5mM,然后在20℃-40℃、80-220rpm条件下诱导培养9-36小时,菌液离心,取上清液,回收蛋白。
进一步的,所述的液体培养基是含有抗生素的LB液体培养基。
本发明的有益效果是:
1、本发明,采用的表达菌株是枯草芽孢杆菌,该菌株被认证为GRAS(GenerallyRecognized as Safe),在食品工业中可安全应用。它具有很高的应用价值,其培养简单快速,具有较强的分泌蛋白质的能力、非致病性及良好的发酵基础和生产技术。本发明中,SP在该表达系统中是细胞外分泌蛋白,且蛋白较纯净,回收纯化容易,生产操作简单且省时。
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