[发明专利]一种以黄花蒿悬浮细胞系为受体的转iaaM基因提高黄花蒿中青蒿素含量的方法

说明书

本发明公开了一种以黄花蒿悬浮细胞系为受体的转iaaM基因提高黄花蒿中青蒿素含量的方法，构建iaaM基因在黄花蒿腺毛细胞特异表达的载体，利用根癌农杆菌介导法转化黄花蒿悬浮细胞系，获得转基因黄花蒿植株。对转基因黄花蒿植株进行PCR基因扩增检测，并对转基因黄花蒿腺毛细胞发育情况及青蒿素含量进行观察与分析，筛选青蒿素含量显著提高的转基因黄花蒿植株，通过组织培养繁殖建立转基因高青蒿素含量的黄花蒿品系。本发明获得的转基因黄花蒿中青蒿素含量显著提高，转iaaM基因的黄花蒿中青蒿素的含量最高可达21.6mg/g DW，是非转化黄花蒿含量的1.8倍。本发明对于为青蒿素的规模化生产提供高产、稳定新药源具有重要意义。

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种以黄花蒿悬浮细胞系为受体的转iaaM基因提高黄花蒿中青蒿素含量的方法。

背景技术

青蒿素是从植物黄花蒿中提取的含过氧基团的倍半萜内酯药物，是当今疟疾治疗的最理想药物，能有效治疗对传统药物氯奎产生抗药性的疟原虫感染。青蒿素主要从黄花蒿(Artemisia annua L.)中直接提取，或提取黄花蒿中含量较高的青蒿酸，然后半合成而成。目前除黄花蒿外，尚未发现含有青蒿素的其它天然植物资源。因此黄花蒿仍是青蒿素药物生产的惟一药源。

虽然黄花蒿系世界广泛分布品种，但青蒿素含量随产地不同差异极大。研究证明黄花蒿中合成青蒿素的主要部位是其叶片表面的腺毛细胞。由于其合成部位的特异性，黄花蒿中青蒿素的含量仅占叶片干重的0.8％—1.4％，因而使其分离成本高、产量低、废弃物多。

野生黄花蒿中青蒿素含量很低，主要集中在0.1％—0.60％之间，高者也仅为0.8％左右。通过杂交和定向育种开展了大量提高黄花蒿中青蒿素含量的尝试，但目前报道的最高青蒿素含量也未超过1.4％，说明了常规选育方法的局限性。

青蒿素主要在黄花蒿腺毛中合成、分泌及储存，通过增大黄花蒿腺毛的密度及大小，能够有效地增加黄花蒿中青蒿素的含量。因此，将生长素合成酶关键基因iaaM转入能够促进黄花蒿腺毛细胞的生长发育，增大其密度或大小；提高腺毛细胞代谢水平从而增加黄花蒿中青蒿素的合成，进而提高黄花蒿中青蒿素的含量。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种以黄花蒿悬浮细胞系为受体的转iaaM基因提高黄花蒿中青蒿素含量的方法。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

所述以黄花蒿悬浮细胞系为受体的转iaaM基因提高黄花蒿中青蒿素含量的方法包括如下步骤：

(1)黄花蒿腺毛细胞特异表达基因的载体重组构建：

将黄花蒿腺毛特异启动子AaGTpro和iaaM基因构建到Ti质粒的T-DNA区，以HPT基因为选择标记基因，以pWM101作为出发载体进行改造和载体构建；得到重组Ti质粒pWM101-AaGTpro::iaaM，所述黄花蒿腺毛特异启动子AaGTpro的序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)工程化根癌农杆菌的制备：

构建的重组Ti质粒通过电激转化法转化根癌农杆菌LBA4404(市售)，经过抗生素筛选和分子检测验证工程农杆菌，培养工程农杆菌至对数生长后期；

(3)黄花蒿悬浮细胞系的建立：

将深绿色或淡黄色生长快、结构疏松颗粒状的黄花蒿愈伤组织置于100mLMS液体培养基中，将愈伤轻轻夹碎，摇床150r/min，光照周期为16h/8h光暗交替，温度为25±2℃振荡培养；培养15—20d左右为悬浮细胞的快速增长且细胞活性较高期，选取该时期期的直径在5mm以内的小细胞团及含有单细胞的黄花蒿悬浮细胞系悬浮液，备用；

(4)黄花蒿悬浮细胞的共培浸染转化：