[发明专利]一种基于动物粪便样品构建测序文库的方法及其应用

权利要求书

1.一种基于动物粪便样品构建测序文库的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)对粪便样品进行预处理，制备样品悬液；(2)从样品悬液中提取RNA，检测提取得到的RNA的浓度≧25ng/μL(3)反转录；(4)构建测序文库。

2.根据权利要求1所述的基于动物粪便样品构建测序文库的方法，其特征在于，所述样品悬液的制备方法如下：向粪便样品中加入PBS缓冲液，机械震荡器震荡至固体样本充分溶解；用冷冻离心机在12000rpm条件下离心10min；吸取上清，并用0.45μm水性滤膜对上清进行过滤，重复一次，收集滤液，即得到所述样品悬液。

3.根据权利要求2所述的基于动物粪便样品构建测序文库的方法，其特征在于，所述粪便样品与PBS缓冲液的用量之比为(5-7)：(3-5)，所述粪便样品以g计，所述PBS缓冲液以mL计。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的基于动物粪便样品构建测序文库的方法，其特征在于，所述动物粪便样品为猪粪样品、牛粪样品或羊粪样品。

5.根据权利要求4所述的基于动物粪便样品构建测序文库的方法，其特征在于，所述动物粪便样品通过用取样勺挑开新鲜粪便表面，插入粪便内部挑取得到或取自-80℃环境中的冻存粪便样品。

6.根据权利要求1或2或3或5任意一项所述的基于动物粪便样品构建测序文库的方法，其特征在于，还包括如下步骤：配制样品悬液后对样品悬液中RNA的浓度进行检测，若所检测到的样品悬液中的RNA浓度大于等于35ng/μL，采用天根病毒RNA/DNA提取试剂盒提取样品悬液中的RNA；若样品悬液中的RNA浓度小于35ng/μL，采用Trizol法提取样品悬液中的RNA。

7.根据权利要求1所述的基于动物粪便样品构建测序文库的方法，其特征在于，所述反转录的方法如下：首先进行反转一链，从-20℃冰箱中取出反转一链的试剂以及酶，充分混匀，离心，将试剂以及酶置于冰盒上，配制反应体系：

然后混合均匀，微离心后，70℃孵育10min,然后迅速冰浴2min，再加入5*RT buffer 4μl，DTT 2μl，42℃孵育2min,最后加入HiFiscript 1μl,混合均匀后，42℃孵育50min，85℃孵育5min。然后再从-20℃中取出反转二链的试剂，置于冰上，配制反应体系，

配制完成后，混合均匀，短暂离心，15℃孵育2h,反应完毕后加入5μL0.5M EDTA(PH8.0),并用磁珠进行纯化，得到样本DNA；所述反转一链采用HiFiScript cDNA第一链合成试剂盒，所述反转二链采用cDNA第二链合成试剂盒。

8.根据权利要求1所述的基于动物粪便样品构建测序文库的方法，其特征在于，所述构建测序文库的方法如下：首先对反转录得到的样本DNA进行末端修复，从-20℃冰箱中取出末端修复缓冲液溶解，充分混匀，将末端修复缓冲液和末端修复酶，置于冰盒上，配制反应体系，

配制完成后，混合均匀，12℃孵育15min，37℃孵育15min，72℃孵育20min，HOLD ON 4℃。反应结束后，短暂离心，加入如下配制连接反应体系：

配制完成后，混合均匀，短暂离心，20℃孵育15min，反应结束后，用磁珠进行纯化。将纯化后连接好接头的反应溶液再次进行扩增，配制扩增反应体系：

PCR反应体系配制完成后，混合均匀并微离心，将样本置于PCR仪中，运行如下PCR反应程序：预变性：98℃，30s；变性：98℃，10s；退火：65℃，30s；延伸：72℃，30s，其中变性、退火和延伸重复15个循环；终延伸：72℃，5min；

PCR反应程序结束后，利用磁珠进行纯化，回收DNA，并溶于10μL的TE缓冲液中，检测DNA文库的浓度，并对DNA文库进行凝胶电泳。

9.权利要求1-8任意一项所述的基于动物粪便样品构建测序文库的方法在病毒检测、病毒鉴定、未知病毒的发现、公共卫生环境检测、环境保护和饲料添加剂选择方面的应用。