[发明专利]过表达小檗碱桥接酶提高博落回中BAIs含量的方法及应用

权利要求书

1.一种过表达小檗碱桥接酶提高博落回中BAIs含量的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

S1、目的基因克隆：对博落回体内催化(S)-网状番荔枝碱，产生(S)-金黄紫堇碱的功能基因McBBE，即目的基因，进行克隆；基因McBBE的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

S2、过表达载体构建：利用双酶切对表达载体进行酶切，然后进行Infusion反应将步骤S1克隆的目的基因McBBE整合到切割好的表达载体中，构成过表达载体；

S3、农杆菌转化以及过表达博落回阳性植株的获得：

S31、农杆菌的转化：将构建好的过表达载体加入到已在冰上融化的农杆菌感受态中进行转化，然后对转化完成的农杆菌进行培养，接着挑取已长出的单菌落做菌落PCR鉴定，选择阳性菌落标号并进行PCR克隆，然后测序、培养、保存，即制得农杆菌浸染液；

S32、用转化后的农杆菌真空介导法浸染博落回外植体：用步骤S31制备好的农杆菌侵染液倒入博落回无菌组培苗外植体浸染，置25～30℃摇床上80～120rpm慢摇8～12min，然后置于真空冷冻干燥机中连续抽真空8～12min；

S33、培养获得博落回植株：将浸染后的无菌组培苗外植体培养得到博落回愈伤组织；待愈伤组织分化长出抗性芽然后转至生根筛选培养基进行扩繁；

S34、采用GUS染色筛选过表达博落回阳性植株。

2.根据权利要求1所述的过表达小檗碱桥接酶提高博落回中BAIs含量的方法，其特征在于，步骤S2具体如下：

配置双酶切反应体系，采用两种内切酶切割表达载体，之后通过Infusion反应连接目的基因McBBE，然后将连接好的产物转入大肠杆菌感受态中，之后用已转化的大肠杆菌菌液提取的质粒，以McBBE-F为上游引物、McBBE-R下游引物进行PCR扩增反应，然后采用凝胶电泳对扩增产物进行检测，若大肠杆菌中的表达载体中已经成功导入目的基因McBBE形成新的过表达载体，则可作为下一步导入农杆菌的载体。

3.根据权利要求1所述的过表达小檗碱桥接酶提高博落回中BAIs含量的方法，其特征在于，

步骤S33中将浸染后的无菌组培苗外植体培养得到博落回愈伤组织的方法具体为：

(1)浸染完成后除去菌液，用无菌滤纸吸干无菌组培苗外植体表面菌液，然后将其转移至含有AS的固体培养基中；

(2)培养3～4天后，用MS培养基清洗外植体，吸干其表面水分，转移至含有50mg/L KM和400mg/L Tic的MS培养基上进行暗培养；

(3)根据农杆菌覆盖情况，重复步骤(2)进行脱菌处理，继代培养直至无菌，15天进行一次继代培养；

(4)暗培养条件下培养三周，无菌组培苗外植体长出愈伤组织，待其抗性芽长至2-2.5cm，转至光培养条件下培养，将单株转至生根培养基上进行扩繁即得；所述生根培养基为含有50mg/L KM、300mg/L Tic、5.7mmol/L IAA、5mmol/L KT以及5mmol/L 2,4-D的MS培养基。

4.根据权利要求1所述的过表达小檗碱桥接酶提高博落回中BAIs含量的方法，其特征在于，

步骤S34中制备博落回无菌组培苗外植体的方法为：

将采摘的博落回外植体进行消毒灭菌处理；然后在无菌工作台中，在博落回外植体上轻划伤口后接种到MS固体培养基上，置于25℃暗培养箱中培养；待长出愈伤，置于25℃光暗结合培养长出无菌组培苗，然后对获得的无菌组培苗通过继代培养或植株再生或外植体引发愈伤的手段进行扩繁。

5.根据权利要求1所述的获取小檗碱桥接酶过表达的博落回植株的方法，其特征在于，

步骤S34中的博落回无菌组培苗外植体为新鲜的博落回组培无菌苗叶片或新鲜的博落回组培无菌苗茎段。

6.根据权利要求1所述的获取小檗碱桥接酶过表达的博落回植株的方法，其特征在于，

步骤S2中双酶切采用KpnI-HF、XBaI-HF两种内切酶。