[发明专利]一种尿苷二磷酸葡萄糖及尿苷二磷酸葡萄糖醛酸的生物合成方法

权利要求书

1.一种尿苷二磷酸葡萄糖的生物合成方法，其特征在于，步骤如下：

(1)在反应液中，以可溶性淀粉和磷酸盐为底物，以含有诱导表达好高温α-葡聚糖磷酸化酶的重组大肠杆菌为催化剂，生物合成得到1-磷酸-葡萄糖；

(2)取步骤(1)得到的1-磷酸-葡萄糖，加入镁离子、磷酸二氢钠缓冲液、尿苷三磷酸，以含有诱导表达好高温糖-1-磷酸核苷酸化酶的重组大肠杆菌为催化剂，生物合成得到尿苷二磷酸葡萄糖。

2.如权利要求1所述的生物合成方法，其特征在于，步骤(1)中包括以下条件：

i.所述可溶性淀粉在反应液中的终浓度为45～55g/L；

ii.所述磷酸盐为KH₂PO₄和K₂HPO₄；

iii.所述含有诱导表达好高温α-葡聚糖磷酸化酶的重组大肠杆菌加量为6～7g菌体干重/L反应液；

iv.所述生物合成的反应温度为70℃，反应时间大于180min。

3.如权利要求2所述的生物合成方法，其特征在于，所述磷酸盐是将KH₂PO₄和K₂HPO₄溶解于水中配制成KP溶液，所述KP溶液中PO₄^3-的总浓度为1M，pH为6～7，所述KP溶液中PO₄^3-在反应液中的终浓度为0.2～0.9M。

4.如权利要求1所述的生物合成方法，其特征在于，步骤(2)中包括以下条件：

i.所述1-磷酸-葡萄糖在反应体系中终浓度为0.4～0.6g/L；

ii.所述磷酸二氢钠缓冲液的组分为NaH₂PO₄ 0.2M，NaOH调节pH6～11；

iii.所述尿苷三磷酸的终浓度为0.05～3.0mM；

iv.所述含有诱导表达好高温糖-1-磷酸核苷酸化酶的重组大肠杆菌的加量为3.0～5.5g菌体干重/L反应液；

v.所述生物合成的反应温度为70～90℃，反应时间大于60min。

5.如权利要求4所述的生物合成方法，其特征在于，所述镁离子由氯化镁水解产生，镁离子的终浓度为10～20mM。

6.如权利要求1所述的生物合成方法，其特征在于，所述诱导表达的步骤包括：

将含有目的基因TmαGP的重组大肠杆菌或含有目的基因StUSP的重组大肠杆菌接种于30mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃225rpm活化12～14h；将活化后的重组大肠杆菌接种于250mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中进行扩大培养，初始OD₆₀₀值为0.05；37℃225rpm培养至OD₆₀₀值为0.6～0.8时，加入终浓度为0.2mM的IPTG诱导，诱导条件为22℃225rpm，18～20h，测量重组大肠杆菌菌液的OD₆₀₀值，即得含有诱导表达好高温α-葡聚糖磷酸化酶的重组大肠杆菌或含有诱导表达好高温糖-1-磷酸核苷酸化酶的重组大肠杆菌；

其中，所述含有目的基因TmαGP的重组大肠杆菌所用质粒载体为pET20b，所用菌株为E.coliBL21(DE3)；所述含有目的基因StUSP的重组大肠杆菌所用质粒载体为pET21b，所用菌株为E.coliBL21(DE3)。

7.如权利要求6所述的生物合成方法，其特征在于，所述含有目的基因TmαGP的重组大肠杆菌诱导表达后的OD₆₀₀值为2.1～2.3；所述含有目的基因StUSP的重组大肠杆菌诱导表达后的OD₆₀₀值为2.4～2.6。