[发明专利]一种重组转氨酶及其在不对称胺化α-羟酮制备手性β-氨基醇中的应用

权利要求书

1.一种重组转氨酶，其特征在于：所述重组转氨酶来源于结核分枝杆菌（Mycobacterium vanbaalenii），重组转氨酶的制备方法为：（1）将编码所述转氨酶的基因插入到质粒中得到重组表达载体；（2）将所述重组表达载体转移到宿主微生物中得到基因工程菌；（3）培养基因工程菌得到重组转氨酶；其中：所述重组表达载体为pET系列载体；所述的宿主微生物为大肠杆菌E. coli。

2.根据权利要求1所述的一种重组转氨酶，其特征在于：所述重组表达载体的构建方法为：

（1）以来源于结核分枝杆菌（Mycobacterium vanbaalenii）的转氨酶MVTA基因序列为模板，引物为：上游引物为GGGAATTCCATATGGGCATCGACACTGGCACCT，下游引物为CCGCTCGAGGTACTGAATCGCTTCAATCAGTG；下划线部分为NdeI和XhoI酶切位点；PCR扩增得到MVTA基因；所述转氨酶MVTA基因序列如如SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列；该转氨酶MVTA的氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示；

（2）回收MVTA基因和pET载体，用限制性内切酶NdeI和XhoI在37℃水浴中酶切2小时，经纯化回收的目的片段与质粒在T4连接酶的作用下室温过夜连接，得到重组表达载体pET28a-MVTA；

（3）将重组表达载体转化至大肠杆菌E. coli BL21(DE3)的感受态细胞中，在含有卡纳霉素抗性的平板上对阳性重组体进行筛选，挑取单菌落PCR验证挑选阳性子即为重组表达载体。

3.根据权利要求2所述的一种重组转氨酶，其特征在于：所述pET载体为pET28a载体。

4.权利要求1或2所述的重组转氨酶在不对称胺化α-羟酮制备手性β-氨基醇中的应用，其特征在于：在pH为6.0-11.0的磷酸缓冲液中，体系温度为20-65℃，α-羟酮为底物，丙酮酸为氨基受体，5-磷酸吡哆醛即PLP为辅因子、重组转氨酶的作用下，底物被拆分反应生成2-羟基苯乙酮，剩下R-苯甘氨醇，其中：重组转氨酶在反应体系中的量为1-20U/mL；PLP在反应体系中的量为0.01-1.0mM；丙酮酸在反应体系中的量为1-300 mM；α-羟酮在反应体系中的量为1-300 mM。

5.权利要求4所述的重组转氨酶在不对称胺化α-羟酮制备手性β-氨基醇中的应用，其特征在于：在pH为6.0-11.0的磷酸缓冲液中，体系温度为20-65℃，2-羟基苯乙酮为底物，R-苯乙胺为氨基受体，5-磷酸吡哆醛即PLP为辅因子、重组转氨酶的作用下，底物被转化生成苯甘氨醇，其中：重组转氨酶在反应体系中的量为1-20U/mL；PLP在反应体系中的量为0.01-1.0mM；R-苯乙胺在反应体系中的量为1-300 mM；2-羟基苯乙酮在反应体系中的量为1-300mM。

6.根据权利要求4所述的重组转氨酶在拆分外消旋苯甘氨醇中的应用，其特征在于：所述磷酸缓冲液pH值为8.0。