[发明专利]一种新型角鲨烯何帕烯环化酶及其应用

说明书

本发明的目的是提供一种新型环化酶，该环化酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。本发明的环化酶可催化角鲨烯转化生成hopene，在催化水解36h后，使大部分的角鲨烯得以转化，体现了该环化酶在hopene制备上的潜能。

技术领域

本发明属于功能酶筛选技术领域，具体涉及一种新型角鲨烯何帕烯环化酶 及其应用。

背景技术

角鲨烯何帕烯环化酶(squalene-hopene cyclase，EC 5.4.99.17)在何帕烷类 生物合成过程中起着十分重要的作用。它进行相当复杂的异构化反应或合成酶 反应,最后使角鲨烯转化成为何帕烯,数年来它一直是有机化学家所致力研究的 对象。同甾醇类物质生物合成的环化反应及其它相似的三萜系化合物环化反应 相比,何帕烷生物合成的环化反应是生物化学中最为复杂的反应,它涉及到5个 环的形成,13个共价键的变化和9个立体结构中心体的形成等。

何帕烷类化合物种类繁多，其中很多已被报道出具有抗炎、抗菌等生理活 性，而何帕烯为何帕烷类化合物生物合成过程中的共同前提物质。目前由于何 帕烯结构复杂还无法实现化学法的合成。从原生菌株或植物中直接提取何帕烷 类化合物存在提取量低，药品消耗大的难题。所以使用酶法转化角鲨烯生成何 帕烯是一种高效、绿色的合成方法。但是目前所发现的角鲨烯何帕烯环化酶 (SHC)均为膜附着蛋白，在制备角鲨烯何帕烯环化酶过程中复杂的分离纯化 方式十分限制其大规模的应用。因此寻找新型SHC，将其应用于何帕烯的制备 中，显得至关重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型非膜结合的角鲨烯何帕烯环化酶，以及利 用该酶高效的转化效率来制备天然何帕烯的方法，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种环化酶，该环化酶包含有：

1)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的酶；

2)在1)中取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，由1)所衍生的，具有 1)中环化酶功能的酶；

编码上述环化酶的基因，其一种核苷酸序列为SEQ ID NO:2；

本发明再一个方面提供一种重组表达载体，该重组表达载体携带有编码上 述环化酶的基因；

本发明还提供重组宿主，用于重组表达上述的环化酶；

本发明的环化酶通过环化反应，转化角鲨烯来制备何帕烯。

进一步的，所述环化反应的最适pH为7.0,温度为30℃,乳化剂为Tween 80。

进一步的，所述环化反应中角鲨烯浓度为20mM,反应时间为36h,加酶 量为0.12-0.16mg/mL。

本发明的环化酶为非膜结合的蛋白，可以直接使用镍柱纯化，避免了膜蛋 白纯化过程中复杂的程序。除此之外，可转化角鲨烯生成何帕烯，在催化36h 后，使大部分的角鲨烯得以转化，从简单的制备方法和较高的转化效率体现了 该环化酶在何帕烯制备上的潜能。

附图说明

图1:本发明的SaSHC催化角鲨烯转化何帕烯的GC/GC-MS结果图；其中a 为反应产物GC检测图，b为hopene裂解示意图，c为GC-MS检测反应产物离 子碎片分布图；

图2：本发明的SaSHC进化树分析图(a)及多重序列比对示意图(b)；

图3：本发明的SaSHC的SDS-PAGE电泳图。泳道M是蛋白Marker，泳道 1是表达后菌体破碎液上清，泳道2是表达后菌体破碎液沉淀，泳道3是纯化 后的SaSHC；

图4：SaSHC最适反应条件优化；其中图a是SaSHC最适温度，图b是SaSHC 的最适pH，图c是表面活性剂对SaSHC活力的影响；