[发明专利]一种神经生长因子的提取方法

说明书

本发明公开了一种神经生长因子的提取方法，包括将含有神经生长因子的上清液酸化离心得到酸解上清液，将所述酸解上清液进行阳离子交换层析，收集含有神经生长因子的目的洗脱峰，得到蛋白液1；将蛋白液1进行疏水层析，收集含有神经生长因子的目的洗脱峰，得到目标蛋白液；其中，该方法不包括阳离子反吸附层析步骤。与现有技术相比，本发明的方法步骤简单，更安全可靠，得到的神经生长因子样品的纯度、收率和样品活性均有提高。本发明不仅适用于鼠神经生长因子的提取，也可适用于人神经生长因子的提取，为神经生长因子的大规模分离纯化提供了新的途径。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及神经生长因子的提取。

背景技术

自1953年意大利科学家Levi-Montalcini发现了神经生长因子(nerve growthfactor，NGF)以来，科学界拉开了对神经生长因子研究的序幕。神经系统疾病是临床上的常见病，但是缺乏有效的防治手段，神经生长因子的发现，给神经系统疾病的治疗带来新的曙光。大量的药效学实验和临床实验结果表明，神经生长因子对周围神经损伤、周围神经病、周围神经中毒性疾病、脑外伤、视神经损伤等具有潜在的或明显的疗效。

完整的神经生长因子由α、β、γ三种亚基通过非共价键以α₂β₂γ₂的形式组成，沉降系数为7，故又称之为7S NGF。7S NGF包含2个锌原子，以增加其稳定性。两个α亚基无生物学活性，两个γ亚基是一种特异性蛋白酶，在NGF结构成熟过程中发生作用。β亚基由118氨基酸残基组成，有三对二硫键，两个β亚基又称为β-NGF，具有NGF的全部生物学功能，沉降系数为2.5，故又称2.5S NGF。不同来源的NGF(如来源于鼠、人、蛇、牛等的NGF)尽管分子量、等电点等理化性质有不同，但是β-NGF的基因编码的氨基酸序列、链内二硫键都非常相似，其中人和鼠的氨基酸序列同源性达到89％。

正是由于神经生长因子的临床效果明显，对NGF的制备方式研究也是在不断的发展。纯化制备文献或专利报道较多的是提取鼠神经生长因子mNGF(mouse NGF)和人神经生长因子hNGF(human NGF)。

从小鼠颌下腺中提取的mNGF为天然的鼠神经生长因子。因小鼠颌下腺中鼠神经生长因子的含量特别丰富，且动物小鼠来源广泛稳定，故已成为天然鼠神经生长因子提取的首选来源。舒泰神公司上市的“苏肽生”(注射用鼠神经生长因子)和武汉海特的“金路捷”、北大之路的“恩经复”和丽珠集团的“丽康乐”均为从小鼠颌下腺中提取的鼠神经生长因子。发展至今，mNGF的制备方法得到了深度研究，目前来看从鼠中提取鼠神经生长因子主要参考Mobley的方法：该提取方法先用CM羧甲基弱阳离子填料进行反吸附层析，然后在低pH条件进行酸化，各亚基进行分离，然后通过梯度洗脱获得β-NGF，该纯化过程中需要使用到两步透析过程。透析的方法无法控制热源，时间长、操作复杂不适合大规模生产；为了解决上述问题，2015年舒泰神申请了公开号为CN106279397A、名称为“一种神经生长因子的提取方法”的专利，其中保护的是一种从小鼠颌下腺中提取mNGF的方法，该方法使用疏水层析能达到去除两步透析步骤的目的，同时在保持mNGF纯度和收率的情况下，终产品在均一性、活性上有明显提高。

然而，上述mNGF的制备方法不能直接用于hNGF的制备，因为经常会出现收率低、活性受到影响的问题。至今为止针对人神经生长因子的制备方法研究还比较少。人神经生长因子提取制备来源主要有人类胎盘和重组表达，已知的制备方法存在步骤复杂、产率低等问题，导致不利于大规模制备。

因此，研究一种方法简单、安全可靠，且能保证所获得的NGF活性高、收率高、适用范围广的神经生长因子提取方法迫在眉睫。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种神经生长因子的提取方法，所述方法简单，安全可靠，且能保证所获得的NGF纯度高、活性高、收率高，不仅适用于鼠神经生长因子的提取，而且适用于人神经生长因子的提取。