[发明专利]基于微流控微珠阵列芯片循环核酸检测试剂盒及应用方法

说明书

本发明属于生物分子检测技术领域，公开了一种基于微流控微珠阵列芯片循环核酸检测试剂盒及应用方法，基于微流控微珠阵列芯片循环核酸检测试剂盒，包括有：捕获探针功能化微球的微流控检测芯片；四条LAMP引物及LAMP扩增试剂；LAMP基础结构环化试剂及环化辅助探针；滚环扩增试剂；信号探针修饰的石墨烯量子点。本发明的方法操作简单、灵敏度极高，可通过血液中EB病毒的检测实现鼻咽癌的早期诊断。本发明首次将微流控动态微阵列芯片的微量及高灵敏检测特性、高灵敏目标物多重信号扩增(包含环介导等温扩增和滚环放大)及功能化石墨烯量子点荧光信号放大整合起来，可以检测到10amol/L的EB病毒DNA。

技术领域

本发明属于生物分子检测技术领域，尤其涉及一种基于微流控微珠阵列芯片循环核酸检测试剂盒及应用方法。

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：

循环肿瘤核酸(ctDNA)在血液中浓度低且存在高水平的正常循环DNA的干扰，因此建立快速、高灵敏ctDNA检测方法是一个很有挑战性的工作。在过去的十年中，许多极具发展潜力的分析技术被提出用于ctDNA的检测，特别是从2012年到现在，一些新的概念和测试方法被引入这一领域。例如：基于定量PCR的技术体系(如Amplification RefractoryMutation System(ARMS),SNPase-ARMS qPCR,mutant-enriched PCR等)，基于数字PCR的技术体系(如Droplet digital PCR,Chip digital PCR等)，基于靶向杂交的技术体系(如表面增强拉曼光谱、局域表面等离子体共振等)。虽然这些技术都有着独特的不可替代的优势及特点，而且在相关领域也得到了较好的应用，但部分局限性(如成本较高、灵敏度低，不适合发展高通量技术等)制约了这些技术在肿瘤临床诊断领域获得更加广泛及深入的应用,另外，这些技术难以解决微量医学分析技术领域或微创、无创诊断领域中存在的微量样品条件下高通量、高灵敏特性难以并存的难题。

EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)，是一种疱疹病毒，于1964年由爱泼斯坦和巴尔发现并命名,别名人类疱疹病毒4型(HHV-4)。自EB病毒的发现以来，因为感染EB病毒导致的病例的报道日益增多。目前认为，EB病毒与伯基特氏淋巴癌(Burkitt's lymphoma)、NK/T细胞淋巴瘤(Natural killeri T-cell lymphoma)、唇癌(Cheilocarcinoma)、鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)、何杰金氏淋巴癌(HD)、子宫颈癌(Cervicalcarcinoma)等有关。目前对鼻咽癌的发生致病机制的研究最为成熟，通过检测血液中的循环EB病毒，可以早期鼻咽癌诊断。目前对EB病毒的检测的方法主要有三种：病毒测定培养法、免疫学检测技术以及分子生物学检测技术，但是这些检测方法都相对存在一定的缺陷，如：需要昂贵的仪器设备、假阳性高、检测成本高、分析周期长、实验过程繁琐等，只适合在高危地区(如中国香港、广东等地区)的人群中开展筛选，对于低危地区的普通人根本难以承担检测所带来的一系列的高额费用。另外，由于EB病毒的在人体内具有较长潜伏期，鼻咽癌早期病人血液中的EB病毒DNA的含量极低，现有常规技术由于灵敏度低、需要样品量大等缺点难以发展成为临床检测技术，因此发展一种性价比高、操作简单、准确率高、高灵敏、检测快速的微量临床检测新技术显得尤为重要。

综上所述，现有技术存在的问题是：

(1)现有技术中这些检测方法都相对存在一定的缺陷，如：需要昂贵的仪器设备、假阳性高、检测成本高、分析周期长、实验过程繁琐等，只适合在高危地区(如中国香港、广东等地区)的人群中开展筛选，对于低危地区的普通人根本难以承担检测所带来的一系列的高额费用；

(2)现有常规技术由于灵敏度低、需要样品量大等缺点难以发展成为临床检测技术，尤其是难于检测血液样本中浓度极低的目标DNA

(3)难以解决微量医学分析技术领域或微创、无创诊断领域中存在的微量样品条件下高通量、高灵敏特性难以并存的难题。