[发明专利]一种提高烟叶提取物中氧化酶酶活的提取方法

说明书

本申请属于烟草代谢物技术领域，具体涉及一种提高烟叶提取物中氧化酶酶活的提取方法专利申请事宜。该方法针对新鲜烟叶中氧化酶的提取，具体包括：制备提取液（采用裂解液RIPA、缓冲液NEB或PBS）、烟叶预处理、溶液法提取等步骤。初步测定结果表明，提取液中SOD酶活得到了较好提高，可达3.7U/μg全蛋白，POD酶活可达6.3×10^‑3U/μg全蛋白，而COX酶活可达5.1×10^‑3U/μg全蛋白，较好达到了减少杂质蛋白干扰、提升氧化酶含量的目的。同时由于相关提取方法简单快速、耗时较短（仅1.5 h左右），因此使得本申请具有较好的科研价值，可为相关酶活性分析及其它相关蛋白分析和研究奠定技术基础。

技术领域

本申请属于烟草代谢物技术领域，具体涉及一种提高烟叶提取物中氧化酶酶活的提取方法专利申请事宜。

背景技术

烟草作为一种较为特殊的经济作物，其产量与品质直接关系到我国国民经济的健康发展。为了研究烟草基因功能，创制新的育种材料，对烟草代谢物进行深入研究和分析显然具有十分重要的意义。

SOD是广泛存在于需氧生物细胞内的一族含金属辅助因子的酶，催化O₂^-的歧化反应，生成H₂O和O₂，而H₂O₂在过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH—Px)催化下转化为水而得以清除。因此，SOD是生物体抗氧化胁迫的关键酶类，其活性决定了O₂^-和H₂O₂的浓度。烟叶生长发育过程中经常会遇到干旱、低温等环境胁迫，在这些胁迫条件下，烟苗内的内源性抗氧化剂的含量会发生显著下降，同时细胞膜透性增大，O₂^-大量产生，积累膜脂过氧化产物，并随环境胁迫时间的延长而增加。随着膜脂过氧化作用的加剧，活性氧生成与清除机制的失衡，烟苗的生长发育和烟叶品质会产生不可逆转的不良影响。

而过氧化物酶( peroxidase，POD) 与细胞色素氧化酶是生物体内另外两种与氧化高度相关的生物酶，其中过氧化物酶( peroxidase，POD)能催化脂肪酸、芳香胺和酚类物质的氧化，是木质素合成的关键酶之一 ，还参与乙烯的生物合成和氧自由基的消除反应。同时，POD与植物的抗病性也有密切的关系。细胞色素氧化酶是一种高等生物呼吸链中的末端氧化酶，其负责催化的将电子从细胞色素C (cytc) 传到O₂的反应是能量代谢中的主要不可逆步骤，也是线粒体呼吸控制中的主要部位。

由于氧化酶类蛋白在植物生长发育过程的重要性，因此，对于生长过程中氧化酶类酶活的准确分析，对于植物生理生长研究以及植物新品种、新材料筛选和鉴定都具有重要意义。

现有技术中，植物蛋白（包括生物酶）的提取方法主要有两种：溶液法和沉淀法。其中沉淀法因其提取过程中采用了变性剂，会导致部分蛋白酶结构改变并失去活性，因此沉淀法并不适合烟草叶片全蛋白的提取。而在应用溶液法进行提取时，由于不同蛋白（生物酶）特性不同，因此具体提取所选择的提取液及提取工艺也往往缺乏可借鉴性，往往均需重新设计。而现有技术中尚未见到较好的提取氧化酶类提取方法报道。

发明内容

本申请目的在于提供一种提高烟叶提取物中氧化酶酶活酶活提取方法，从而为烟草生长代谢研究奠定一定方法学基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

一种提高烟叶提取物中氧化酶酶活的提取方法，该方法针对新鲜烟叶中氧化酶的提取，所述氧化酶主要指：超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶( peroxidase，POD)和细胞色素C氧化酶（COX）；具体包括如下步骤：

（1）制备提取液，具体可采用裂解液RIPA、NEB或PBS；配方组成为：