[发明专利]一株产重楼皂苷的尖孢镰刀菌DCLZJ-4菌株及其用途

说明书

本发明涉及一种产重楼皂苷的尖孢镰刀菌DCLZJ‑4菌株，本菌株是从滇重楼中采用内生真菌分离纯化的方法分离培养获得的，经微生物鉴定为镰刀菌属（Fusarium sp.）。该菌株保藏于中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心，地址：中国，北京，中国科学院微生物研究所；邮编100101，保藏日期为2017年10月30日，保藏编号为：CGMCC No.14791；该菌株的ITS rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。上述菌株能够用于发酵制备重楼皂苷。本发明为规模化发酵制备重楼皂苷提供一株性状稳定、培养基简单、生长良好的尖孢镰刀菌菌株、实用简便的发酵及分离提取工艺，其发酵液经提取浓缩后的浸膏可作为止血类药物的活性成分或者是药用载体。

技术领域

本发明涉及一种尖孢镰刀菌菌株，该菌株可产重楼皂苷，属于微生物技术领域。

背景技术

植物内生菌具有强大的代谢功能，能够产生与宿主相同或相似的活性成分，广泛存在于多种植物中，可通过合适的培养条件从植物中培养分离出来。目前植物内生菌的研究逐渐受到重视，不同植物的各种内生菌相继被发现。内生菌种类的多样性也赋予了其代谢产物的多样性，利用内生菌发酵的方法用于挖掘新资源具有巨大的潜力。随着人们对药用植物内生菌的逐步研究，利用能够代谢产生相应活性成分的内生菌来生产新型、高效、低成本的活性药物，解决珍稀中药植物资源紧缺的现状，将成为药用植物内生菌研究的重点。

中药重楼具有显著的药理活性，临床应用广泛，是云南白药、宫血宁等多种中成药的主要原料之一，但重楼生长周期长、生长速度慢，引种驯化没有取得突破性进展，价格居高不下，道地野生资源破坏严重，重楼资源面临枯竭的危险。研究表明重楼植物中也存在大量内生菌，能够产生活性代谢产物。目前已有一些学者筛选出了一些产皂苷或其类似物的内生菌，但菌株数量及种类都不多，继续筛选出一些新的产皂苷或皂苷元的菌株，对深入开展微生物发酵产皂苷或皂苷元的途径的研究具有重要意义。从重楼植物体中筛选出可代谢产生重楼皂苷的内生菌，为解决重楼紧缺的现状提供了一条新的途径。

Wang Q等采集了嵩明、宝山、鹤庆等地的滇重楼中的内生真菌，从根、块茎、叶中分离到749株内生真菌，魏娟等从野生滇重楼和人工培育的滇重楼中分别分离出44株和40株内生细菌。张鹏等发现了1株能够产重楼皂苷Ⅰ的内生阴沟肠杆菌和2株能够产重楼皂苷Ⅵ的内生大肠杆菌和解淀粉芽孢杆菌。任智，赵明，张晓杰，曹晓东等也分离到了能够产甾体皂苷的重楼内生菌。说明重楼内生菌的品种繁多，具有很强的生物学活性，能够产皂苷类化合物。

重楼内生菌近几年来才开始受到人们的关注，但关于重楼内生菌尤其是能够代谢产生相应甾体皂苷成分的研究依然相对较少，并且大部分集中在华重楼方面，而滇重楼内生菌的研究也主要集中在生物多样性方面，对内生菌产重楼皂苷代谢产物的研究还较少。

发明内容

本发明解决了背景技术中的问题，提供了一种产多种重楼皂苷的尖孢镰刀菌DCLZJ-4菌株。

本发明的目的是提供一种产重楼皂的尖孢镰刀菌DCLZJ-4菌株、制备方法、发酵培养方法及其发酵液制成的浸膏在制备治疗/预防止血类药物中的应用。

本发明的目的是这样实现的，

一种镰刀菌属尖孢镰刀菌DCLZJ-4菌株，其保藏编号为CGMCC No.14791。

镰刀菌属尖孢镰刀菌DCLZJ-4菌株的制备方法，其特征在于包括清洗消毒、接种、分离、培养及保存，具体步骤为：

a) 清洗消毒：将采集的新鲜重楼块茎洗净后，除去表面坏死的硬物部分，用75％的乙醇进行表面消毒20min，然后用无菌水清洗3～5次；

b) 接种：将步骤a)处理的重楼块茎放入事先灭菌备用的研钵中，加5mL无菌水研磨成白色悬浊液；用移液器取300μL悬浊液于各个PDA培养基平板中，用无菌涂棒涂匀；并于第3、5、7、9d分别拍照记录，若真菌长满平板则不再进行分离，并灭菌处理；