[发明专利]一种魁蚶来源的具有免疫增强活性的β-1，3葡聚糖内切酶及其编码多核苷酸

权利要求书

1.具有免疫增强活性的魁蚶(Arca inflata Reeve)β-1，3葡聚糖内切酶，其氨基酸序列为：SEQ ID NO.1。

2.权利要求1所述的免疫增强活性的β-1，3葡聚糖内切酶的分离制备方法，其特征在于包括如下步骤：

将魁蚶剥壳，取其内容物，用低温蒸馏水清洗三次，控干后称重，按照1∶3的重量比例加入pH＝8.0，0.03mol/L磷酸钠的提取缓冲液，采用高速组织捣碎机，以8000×g间隔匀浆3min至细腻无块状，将匀浆液置于低频超声仪中超声提取40min，使用低温高速离心机，10000×g，4℃，离心30min去渣，量取上清液的体积后将其置于冰浴环境中加入70％饱和度的硫酸铵后，继续搅拌盐析1h后，高速离心除去沉淀取上清液，量取体积后加入100％饱和度的硫酸铵，再继续搅拌盐析1h后，10000×g，4℃，离心30min，收集沉淀；将沉淀用少量提取液溶解后置于3000D透析袋中透析24h以除盐，每间隔6h更换外周蒸馏水；将具有酶活性盐析组分使用DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析进行分离，用pH为8.0的0.03mol/L的Tris-HCl缓冲液作为初始洗脱液，通过增加氯化钠的浓度进行阶段洗脱，280nm处检测吸收峰，收集具有β-1，3葡聚糖内切酶活性的0.1mol/L氯化钠洗脱的洗脱液，透析脱盐后，再使用Phenyl Sepharose CL-4B疏水层析柱分离；首先用1.0mol/L，pH为8.0的硫酸铵-磷酸缓冲液进行洗脱，然后依次用含0.5mol/L和0mol/L，pH 8.0的硫酸铵-磷酸钠缓冲液进行阶段洗脱，280nm处检测吸收峰，收集含有1.0mol/L硫酸铵的磷酸钠缓冲液洗脱的洗脱液，透析脱盐后，再经分子排阻凝胶Sephadex G50层析柱分离；使用含有0.1mol/L氯化钠的磷酸钠缓冲液进行等度洗脱，收集第一个洗脱峰，浓缩冷冻干燥，得到了魁蚶中β-1，3葡聚糖内切酶。

3.编码权利要求1所述的β-1，3葡聚糖内切酶的基因，序列为：SEQ ID NO.2。

4.含权利要求3所述β-1，3葡聚糖内切酶的基因的pET-28a(+)重组质粒。

5.含权利要求4所述的重组质粒的重组微生物E.coli BL21(DE3)。

6.根据权利要求5所述的重组微生物E.coli BL21(DE3)，其构建流程如下：

用分别含NdeI和HindIII的正反向PCR引物从阳性克隆子中扩增出的如权利要求3所述的β-1，3葡聚糖内切酶的基因；经NdeI和HindIII双酶切后和同样用这两种酶切好的pET-28a(+)进行酶连，酶连好的含β-1，3葡聚糖内切酶的基因的pET-28a(+)重组质粒转化到表达宿主菌E.coli BL21(DE3)获得重组微生物E.coli BL21(DE3)，转接到含有质量比50mg/L卡那霉素平板，37℃培养16h后挑取阳性转化子，经测序验证基因序列无误后，保存。

7.权利要求1所述魁蚶β-1，3葡聚糖内切酶或权利要求3所述的β-1，3葡聚糖内切酶的基因在β-1，3葡聚糖水解方面的应用。

8.权利要求1所述魁蚶β-1，3葡聚糖内切酶或权利要求3所述的β-1，3葡聚糖内切酶的基因在制备免疫增强剂中的应用。