[发明专利]降解肺炎克雷伯氏菌荚膜多糖及生物被膜的噬菌体解聚酶

说明书

本发明公开了一种降解肺炎克雷伯氏菌荚膜多糖及生物被膜的噬菌体解聚酶，通过对肺炎克雷伯氏菌噬菌体GH‑K3基因组中第32个开放阅读框进行原核表达和纯化，获得了全新并具有高效活性的解聚酶depo32。该解聚酶对肺炎克雷伯氏菌所形成的荚膜多糖和生物被膜具有高效降解作用。

技术领域

本发明公开了一种降解肺炎克雷伯氏菌荚膜多糖及生物被膜的噬菌体解聚酶，涉及一种应用噬菌体解聚酶降解肺炎克雷伯氏菌所形成生物被膜的方法，属于生物技术领域。

背景技术

肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）是一种常见的人畜共患病原菌。近年来，多重耐药肺炎克雷伯氏菌已成为医源性感染的最主要病原体之一。该细菌不但对人类公共卫生事业造成了巨大威胁，而且在一定程度影响了动物养殖业的健康发展。

大多数肺炎克雷伯氏菌具有合成和分泌荚膜多糖的能力。荚膜多糖作为细菌的天然屏障可维持细菌毒力、粘附、阻断一些抗生素渗透。作为肺炎克雷伯氏菌的重要毒力因子，荚膜多糖对公众健康构成巨大威胁。此外，一些肺炎克雷伯氏菌可形成生物被膜，即由细菌自身产生的胞外多糖基质、脂蛋白、纤维蛋白等所包裹的细菌细胞所形成的膜状结构，能显著提高细菌对抗生素的耐药性及逃避宿主免疫系统识别的能力，从而加速细菌在病灶内的定植。因此，生物被膜是医院内细菌感染的主要致病因素。另外，生物被膜能够稳定地附着于医用器械表面，通过常规物理化学手段难以清除，这给防控医疗继发感染带来了严峻考验。

噬菌体解聚酶（depolymerase）通过降解细菌表面多糖，进而引导噬菌体吸附于宿主外膜蛋白。该酶通过随机攻击糖苷键以释放聚合物的重复单元，实现靶向降解荚膜多糖。诸多国内外研究表明，噬菌体解聚酶可有效清除并抑制生物被膜的形成，在控制病原感染等公共卫生领域具备一定的应用潜力。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种应用噬菌体解聚酶降解细菌荚膜多糖，清除和抑制肺炎克雷伯氏菌生物被膜的方法。

本发明还提供了一种噬菌体解聚酶Depo32，通过对肺炎克雷伯氏菌噬菌体GH-K3基因组中第32个开放阅读框进行原核表达和纯化，获得了全新并具有高效活性的解聚酶depo32。该解聚酶对肺炎克雷伯氏菌所形成的荚膜多糖和生物被膜具有高效降解作用。

本发明公开一种肺炎克雷伯氏菌噬菌体GH-K3，所述的菌株已于2018年7月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏名为 Klebsiella pneumonia phage GH-K3，保藏编号为：CCTCC NO:M 2018455。

本发明所述的一种噬菌体解聚酶Depo32，其特征在于：对肺炎克雷伯氏菌噬菌体GH-K3第32位开放阅读框（depo32），进行原核表达和纯化而获得的解聚酶，核苷酸序列如SEQ No.1所示；氨基酸序列如SEQ No.2所示。

本发明所述的噬菌体解聚酶Depo32的制备方法，包括以下步骤：

1）通过PCR、双酶切、连接分子克隆手段，将来自肺炎克雷伯氏菌噬菌体GH-K3第32位开放阅读框的depo32基因连接至pET28a质粒：酶切位点Nde I和Xho I；

2）将pET28a-depo32质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)，筛选得到BL21-depo32大肠杆菌；

3）将BL21-depo32在1L含有50 μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至对数生长期（OD₆₀₀ 0.6~1.0）；