[发明专利]一种基于实时荧光PCR检测短短芽孢杆菌的引物和探针、试剂及其试剂盒与方法

权利要求书

1.一种基于实时荧光PCR检测短短芽孢杆菌的引物和探针，其特征在于，所述引物包括上游引物P1以及下游引物P2；

所述上游引物P1具有SEQ No.1序列；

所述下游引物P2具有SEQ No.2序列；

所述探针具有SEQ No.3序列。

2.根据权利要求1所述基于实时荧光PCR检测短短芽孢杆菌的引物和探针，其特征在于，所述探针的5'端用报告荧光染料FAM标记，所述探针的3'端用淬灭荧光染料TAMRA标记。

3.一种基于实时荧光PCR检测短短芽孢杆菌的试剂，其特征在于，所述试剂中含有权利要求1所述的引物和探针。

4.一种基于实时荧光PCR检测短短芽孢杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求1所述的引物和探针或含有权利要求3所述的试剂。

5.根据权利要求4所述基于实时荧光PCR检测短短芽孢杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有DNA聚合酶反应液、空白对照品、阳性对照品以及阴性对照品。

6.一种检测短短芽孢杆菌的实时荧光PCR方法，所述方法采用权利要求1所述引物和探针或权利要求3所述试剂或权利要求4、5所述试剂盒，其特征在于，具体步骤如下：

——提取待测样品基因组DNA；

——以所提取得DNA为模板，加入引物、探针以及DNA聚合酶反应液进行实时荧光PCR反应，其中，反应条件为：94℃15min，循环1次；94℃3s，59℃32s，循环40次，记录样品反应Ct值；

——在样品检测的同时，设置空白对照、阴性对照以及阳性对照，其中，空白对照以ddH₂0为模板，按照上述条件进行实时荧光PCR反应，检测Ct值大于或等于40；阴性对照以非短短芽孢杆菌物种基因组DNA为模板，按按照上述条件进行实时荧光PCR反应，检测Ct值大于或等于40；阳性对照以短短芽孢杆菌基因组DNA或目的基因质粒片段为模板，按照上述条件进行实时荧光PCR反应，检测Ct值小于或等于35；

——若待测样品短短芽孢杆菌基因检测Ct值大于或等于40，阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，判定该待测样品未检出短短芽孢杆菌基因；若待测样品短短芽孢杆菌基因检测Ct值小于或等于35，阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，判定该待测样品检出短短芽孢杆菌基因；若待测样品短短芽孢杆菌基因检测Ct值在35～40之间，重做实时荧光PCR扩增，再次扩增后结果Ct值大于40且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，判定该待测样品未检出短短芽孢杆菌基因，再次扩增后结果Ct值仍小于40且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，判定该检测样品检出短短芽孢杆菌基因。