[发明专利]狗尾草U6启动子基因及应用

说明书

本发明公开了2种狗尾草U6启动子及应用，该2种启动子序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示，通过GUS染色瞬时表达验证，能高效的在狗尾草上表达。在转基因技术领域，这些启动子不仅适用于狗尾草，除用于启动功能基因表达外，在构建RNAi表达载体时可用于启动发夹结构的表达，在CRISPR/Cas9系统中可用于启动sgRNA引导序列的表达等。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及植物转基因技术领域，具体涉及狗尾草U6启动子基因的克隆和应用。

背景技术

狗尾草(Setaria viridis)是谷子(Setaria italica)的野生近缘种，属单子叶植物纲禾本科黍亚科，黍亚科常分布在热带和亚热带地区，高粱、甘蔗、玉米、谷子、薏苡、黄茅、白茅等都属于黍亚科，该科植物具有热带植物的典型特征。是研究C4光合作用的优秀模型，同时也是研究单子叶植物、非生物胁迫耐受性和能源植物的模型。它具有许多适于遗传分析的特性，如二倍体、有相对较小的基因组(～510Mb)、身材矮小、生长周期短和种子量大等。目前狗尾草作为新型模式植物的研究在国内外越来越热门，但还没有人克隆并应用狗尾草本身的U6启动子开展转基因技术研究。

U6启动子是二型启动子，与真核生物RNA聚合酶III结合后，负责转录U6RNA，这类启动子的特点是几乎所有启动子元件(除了+1位的转录起点)都位于转录起始位点的上游，也即它对转录起点后的序列无特殊选择或要求，能保证转录序列的结构特征。U6启动子+1位是鸟苷酸。RNA聚合酶III启动子识别的终止信号是连续4-5个胸苷酸，转录产物末端一般有4个尿苷酸。几乎所有的真核生物都具有U6启动子，U6启动子在真核生物体内一般发现是启动小片段，不带PolyA尾的序列，由RNA聚合酶III聚合U6启动子转录产生shRNA，经剪切后产生成熟siRNA，产生干扰效果；shRNA的表达量取决于启动子的强弱，与同类的RNA聚合酶III的启动子H1相比，U6启动子启动能力更强，表达时间也长。

目前，在转基因技术领域，U6启动子多用在构建RNAi表达载体上，用于启动干扰发夹结构的表达；此外，随着基因编辑技术的兴起，U6启动子也被开始广泛用于CRISPR/Cas9系统中sgRNA引导序列的启动表达，以保证引导序列的结构特征。U6启动子具有种属特异性，在转基因技术中，使用转化物种本身或接近物种的U6启动子能取得更高的的启动效率。前人研究表明，人U6启动子有几个明显的特点：1、具有TATA box，位于-30～-25bp，被PolIII转录；2、在转录起点上游-66～-47bp处存在PSE(proximal sequence element)，该元件是snRNA激活因子蛋白复合物的结合位点；3、在-244～-214存在DSE(distal sequenceelement)；4、启动子下游存在5'-TTTT-3'序列为Pol III提供转录终止信号；5、PSE和DSE之间的距离变化可显著影响转录效率；6、+1位的G对转录效率影响较大。根据这些特点，在使用U6启动子构建RNAi表达载体时，U6启动子的长度最好在300bp左右，尽量不改变PSE和DSE的间距，同时保留TATA box和+1位的G，在下游应有5'-TTTTT-3'序列作为终止信号。另外可以根据需要在启动子上游或终止信号下游设计测序引物序列、酶切位点等等。

发明内容

本发明的目的是提供了狗尾草U6启动子基因，克隆了2个狗尾草U6启动子，并将这2个启动子与GUS基因融合表达转化狗尾草胚性愈伤，通过瞬时表达验证了2个启动子能够在狗尾草上高效表达，为狗尾草及相近植物的转化研究提供了高效的启动子序列。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：提供狗尾草U6启动子基因，包括2种狗尾草U6启动子基因，分别具有序列表中SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

该2种启动子基因序列还包括含有如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示基因序列的其它序列。

启动子序列分别来自于狗尾草Chr_02、Chr_04染色体。