[发明专利]一种类角膜上皮细胞、组织工程化角膜上皮及制备与应用

说明书

本发明属于组织工程技术领域，具体涉及一种以类角膜上皮细胞为种子细胞构建组织工程化角膜上皮的方法与应用。本发明提供了一种采用两步法诱导皮肤来源的表皮细胞转分化为类角膜上皮细胞，以诱导获得的类角膜上皮细胞为种子细胞替代角膜缘干细胞构建组织工程化角膜上皮，制得的组织工程化角膜上皮，具有透明度良好，弹性好，可操作性强等特点，可用于移植修复人类或动物因角膜缘干细胞缺损导致视力严重下降或失明的眼表，用于因角膜缘干细胞缺损而失明的动物模型的自体移植和同种异体移植均能取得良好的效果。

技术领域

本发明属于组织工程技术领域，具体涉及一种类角膜上皮细胞、组织工程化角膜上皮及制备与应用。

背景技术

根据调查统计，在我国角膜盲约占双眼盲患者15.38％，已成为第二位致盲性眼病。我国角膜盲病人每年约400万（包括单眼患者），这些病人中75％以上可以通过角膜移植达到复明的目的。由于角膜供体严重匮乏，我国每年仅有4000例左右手术机率，只占病人的2‰。

构建可用于人体移植的组织工程角膜满足患者需求，成为迫切需要解决的医学难题。以非角膜来源的自体组织干细胞替代角膜缘干细胞构建组织工程角膜上皮是解决这一医学难题的理想选择。国内外学者进行了口腔粘膜上皮细胞、骨髓间充质干细胞、表皮干细胞、毛囊干细胞和胚胎干细胞诱导分化为角膜上皮细胞的研究，试图解决这一难题[Nishida K，et al.2004, N Engl J Med ; 351(12): 1187–1196; Gao N, et al. 2007,Sci China C Life Sci; 50(1): 101-110; Yang XY, et al.2008, Mol Vis ; 14:1064-1070; Ma Y, et al. 2006, Stem Cells ; 24(2): 315 – 321; Meyer-Blazejewska EA,et al.2011, Stem Cells ; 29（1）: 57-66]，这些研究结果表明多种组织干细胞在特定诱导条件下可以转分化为角膜上皮细胞，并促进LSCD眼表修复。但、由于成体干细胞在组织中数量极少、又缺乏特异性分子标记，因此，很难分离分化纯化建立细胞系（Watt FM,etal.2010,Phil.Trans.R.Soc.B;365:155-163）。

皮肤是人类和动物最大的器官，有丰富的细胞来源、如果能将皮肤表皮干细胞诱导成为角膜细胞，并作为组织工程角膜上皮的种子细胞，则能解决这一难题。

发明内容

为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种类角膜上皮细胞的制备方法，该方法可诱导皮肤表皮细胞转分化为类角膜上皮细胞。

本发明的另一目的在于提供上述制备方法制备得到的类角膜上皮细胞。

本发明的再一目的在于提供一种组织工程化角膜上皮，该角膜上皮采用上述类角膜上皮细胞替代角膜缘干细胞构建得到。

本发明的第四个目的在于提供上述类角膜上皮细胞和组织工程化角膜上皮的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种类角膜上皮细胞的制备方法，包含如下步骤：

（1）将人或哺乳动物皮肤表皮细胞，采用含终浓度为30～50μg/mL EGF和20～30ng/mL LIF的无血清培养基诱导培养10～24h，使表皮细胞去分化、回到较原始的状态，得到去分化的表皮细胞；

（2）将步骤（1）制得的去分化的表皮细胞与人或哺乳动物角膜基质成纤维细胞采用transwell共培养系统进行共培养，培养3～5天，使去分化的表皮细胞向角膜上皮细胞分化，得到类角膜上皮细胞；

步骤（1）中所述的人或哺乳动物皮肤表皮细胞可来源于成体皮肤组织，可以通过如下方式获得：