[发明专利]一种高产2;4-二乙酰基间苯三酚的重组菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种高产2,4-二乙酰基间苯三酚的重组菌，其特征在于，所述重组菌过表达聚酮合成酶基因phlD、2,4-二乙酰基间苯三酚合成酶基因phlACB、外排蛋白phlE基因以及编码多重抗性因子的基因marA和编码乙酰辅酶A羧化酶的acc基因，出发菌株为大肠杆菌。

2.根据权利要求1所述的高产2,4-二乙酰基间苯三酚的重组菌，其特征在于，所述大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)。

3.根据权利要求1所述高产2,4-二乙酰基间苯三酚的重组菌，其特征在于，所述基因phlD、phlACB、phlE，均来源于荧光假单胞菌(Pseudomonas protegens CHA0，DSM 19095^T)，或者为来源于其它生物体，和这些基因具有相同或相似功能的核酸序列；所述marA基因来源于大肠杆菌，Genebank ID：6060688，或者为和marA同源性超过70％的核酸序列；或者所述marA基因来源于其它生物体，和marA基因同源性低于70％，但和marA具有相同或相似功能的核酸序列；所述乙酰CoA羧化酶基因acc来源于大肠杆菌，其中，亚基accA的GenebankID：6062185，亚基accB的Genebank ID：6058890，亚基accC的Genebank ID：6058863，亚基accD的Genebank ID：6059083，或者为和acc基因同源性超过70％的核酸序列；或者所述乙酰CoA羧化酶acc基因来源于其它生物体，和acc基因同源性低于70％，但和acc具有相同或相似功能的核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述高产2,4-二乙酰基间苯三酚的重组菌，其特征在于，所述phlD基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；phlACB基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；phlE基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；marA基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

5.权利要求1-4任意一项所述高产2,4-二乙酰基间苯三酚的重组菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：

1)制备含有基因phlD、phlACB、phlE和多重抗性激活因子marA的重组质粒，记为p-phlDACBE/marA；

2)将步骤1)所得的重组质粒和pA-accADBC重组质粒导入到宿主菌中获得重组菌，所述宿主菌为大肠杆菌。

6.根据权利要求5所述的高产2,4-二乙酰基间苯三酚的重组菌的构建方法，其特征在于，步骤1)中所述重组质粒p-phlDACBE/marA的构建方法如下：

以P.protegens CHA0基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得phlD基因，所用正向引物序列phlD-F，核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，反向引物phlD-R，核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；

以P.protegens CHA0基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得phlACB基因，所用正向引物序列phlACB-F，核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，反向引物phlACB-R，核苷酸序列如SEQ IDNo.8所示；

以P.protegens CHA0基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得phlE基因，所用正向引物序列phlE-F，核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，反向引物phlE-R，核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；

以E.coli基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得marA基因，所用正向引物序列marA-F，核苷酸序列如SEQ ID No.11所示，反向引物marA-R，核苷酸序列如SEQ ID No.12所示；

以pET28a(+)为载体，通过酶切连接的方式将上述phlD基因、phlACB基因、phlE基因和多重抗性激活因子marA基因，构建到pET28a(+)载体上，获得重组质粒pET28a-phlDACBE/marA。

7.权利要求1-4任意一项所述的重组菌在提高2,4-二乙酰基间苯三酚产量中的应用。