[发明专利]一种诱导红花大金元发状根及植株再生的方法

说明书

本发明是一种诱导红花大金元发状根及植株再生的方法，通过种子消毒、种子培养、烟草外植体预培养、发根农杆菌培养、侵染与共培养、清洗与发状根培养、发状根愈伤组织培养、分化芽培养、再生植株生根培养等步骤完成。本发明针对烟草品种红花大金元，利用发根农杆菌，通过调节植物激素比例，提高其外植体产生愈伤组织比率，可将烟草组织培养产生新植株的时间缩短至2个月并提高组培苗的生产率。另外，经过分化芽培养步骤，能大大提高分化芽的生根率和存活率。

技术领域

本发明属于植物细胞工程技术领域，具体地说是一种发根农杆菌诱导烟草品种红花大金元外植体产生毛状根，并完成植株再生的方法。

背景技术

发根农杆菌是根瘤菌科（Rhizobiaceae）农杆菌属（agrobacterium）的一种革兰氏阴性土壤细菌，它能够感染大多数双子叶植物和少数单子叶植物以及个别裸子植物。Ri质粒是一种具有侵染性的大质粒，位于发根农杆菌染色体外。在实验室条件下，发根农杆菌可以侵染人为划伤的外植体伤口，以使Ri质粒上的T-DNA中含有的rolB基因能够插入植物细胞核特定的基因当中，在宿主细胞内借助植物本身的DNA复制完成自身的复制与表达，合成特定的蛋白，从而诱导植株产生发状根。发根农杆菌诱导植物细胞产生发状根不仅能在无外源激素的培养基上快速自主生长，而且具有易通过组织培养途径获得再生植株等优势。

ATCC15834发根农杆菌菌株来源于ATCC（美国模式培养物集存库/American typeculture collection），为发根农杆菌原始菌株（wild strain），含有pRi15834农杆碱型Ri质粒，具有广泛的寄主范围（禾本科、豆科、烟草等）。Ar.Qual发根农杆菌菌株含有农杆碱型Ri质粒，具有广泛的宿主范围（玉米、烟草、番茄、柑橘等），同时具有链霉素、氯霉素抗性。MSU440发根农杆菌菌株含有农杆碱型Ri质粒，具有广泛的宿主范围（玉米、烟草、茶树、青蒿等），同时具有链霉素抗性。K599发根农杆菌（NCPPB2659）含有pRi12659农杆碱型Ri质粒，具有广泛的寄主范围（葫芦科、豆科、茄科等），同时具有链霉素抗性。

目前已有许多利用发根农杆菌诱导或转化烟草的相关研究，然而，针对不同品种烟草的培养条件和步骤仍需探索改进，筛选合适的培养基和培养条件能有效提高获得再生植株的效率。

发明内容

本发明的目的是公开一种发根农杆菌诱导烟草红花大金元产生发状根及植株再生的方法。

本发明的技术方案如下：

一种利用不同发根农杆菌菌种诱导烟草红花大金元产生发状根及植株再生的方法，包括如下步骤：

步骤（1），红花大金元种子消毒；

步骤（2），种子培养，将步骤（1）中消毒的种子接种到MS培养基中，待发芽长成幼苗；种子发芽培养条件：温度25±1℃，光照强度30-50μmol/(m²·s)，光照时间为16h/d，培养60d；

步骤（3），烟草外植体预培养，将步骤（2）中得到的幼苗，利用手术刀将烟草叶片切成1cm²左右的叶盘，将叶盘置于MS培养基中进行预培养，培养条件为：25℃，黑暗培养3d；

步骤（4），发根农杆菌培养，发根农杆菌接种在YEB培养基上，28℃暗培养2-3d，挑取发根农杆菌单菌落接种于YEB液体培养基中28℃振荡（200r/min）避光培养至OD600 =0.5-1.0，4℃，3000rpm离心15min收集菌体，用MS液体培养基悬浮菌体至OD600 =0.6-0.8，供感染使用，

步骤（5），侵染与共培养，将步骤（3）中预培养3d的烟草叶盘浸入步骤（4）悬浮菌液中10min，取出叶盘在灭菌滤纸上吸干菌液，并放至MS培养基上共培养，培养条件为：28℃，黑暗培养3d；