[发明专利]抑制和/或敲除基因在提高单克隆抗体的表达量中的应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，特别涉及抑制和/或敲除基因在提高单克隆抗体的表达量中的应用。本发明以E.coli MG1655为出发菌株，利用sRNA技术抑制蛋白酶基因，减少蛋白酶的形成，从而减少蛋白酶对IgG及其片段的降解，进而间接提高IgG抗体的产量，为将来的工业化生产提供理论依据。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及抑制和/或敲除基因在提高单克隆抗体的表达量中的应用。

背景技术

抗体是指一类可以与抗原特异性结合，用来识别和鉴定抗原的免疫球蛋白。抗体分为多克隆抗体和单克隆抗体。与多克隆抗体相比，单克隆抗体最大的不同在于其单一的特异性；即它只能与一个特定的抗原决定簇识别并结合。

随着生物技术的迅猛发展，重组蛋白药物市场发展迅速，且经济价值逐年增加。其中，重组抗体是增长最快、经济价值最大的群体。自2010年以来，抗体药物的年销售额每年增长8％以上。2017年，全球治疗性抗体市场已达1000亿美元。目前，已有200多种抗体药物进入III期临床研究。美国FDA批准了50多种单克隆抗体药物，其中免疫球蛋白G(IgG)类型占比最大。这些数据清楚地表明生产单克隆抗体是生物医学领域中最重要的问题之一。

目前，单克隆抗体主要是在哺乳动物细胞系中产生。然而，哺乳动物细胞系有诸多限制，例如，生长周期长、投资成本高、下游纯化难等。而与哺乳细胞相比，大肠杆菌表达系统具有生长时间短、易于进行分子操作、可以实现高密度发酵、成本低廉等优势，成为生产单克隆抗体的潜在替代宿主，并快速发展。目前，已有两种在大肠杆菌中生产的单克隆抗体片段被美国FDA批准上市：Genentech公司生产的Lucentis(通用名ranibizumab)和USB公司生产的Cimzia(通用名certolizumab pegol)。其中，Lucentis用于治疗糖尿病性视网膜病变；Cimzia用于治疗中重度类风湿性关节炎。

sRNAs(small regulatory RNAs)指非编码RNA，长度一般在几十至几百个核苷酸之间，其可以在翻译水平上调控基因的表达。目前发现sRNA广泛存在于原核生物、真核生物乃至哺乳动物等不同的生物体中。

如图1所示为人工合成sRNA的作用机制。当sRNA不存在时，核糖体(ribosome)与靶mRNA(target mRNA)结合，mRNA可以正常进行后续的翻译(translation)；而当sRNA存在时，sRNA有与靶mRNA互补的序列(sRNA的红色部分)，其竞争性阻断核糖体与靶mRNA的特异性结合，从而有效抑制(repression)靶mRNA的翻译，达到调控基因表达的目的。人工合成的sRNA(synthetic sRNA)设计简单并且可以快速调节原核染色体基因的表达，而不需要复杂的工程。

蛋白酶是催化蛋白质肽链水解的一类酶的总称，分布广泛。目前，现有的一些研究开发了蛋白酶缺陷菌株来减少单克隆抗体片段或其他蛋白质的降解。但是缺少大肠杆菌中蛋白酶对完整IgG抗体影响的研究，尤其是不同类型的蛋白酶对于IgG的作用大小，以及蛋白酶的位置对IgG抗体的影响，都需要通过大量的实验研究进行确定。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了抑制和/或敲除基因在提高单克隆抗体的表达量中的应用。本发明以E.coliMG1655为出发菌株，利用sRNA技术抑制蛋白酶基因，减少蛋白酶的形成，从而减少蛋白酶对IgG及其片段的降解，进而间接提高IgG抗体的产量，为将来的工业化生产提供理论依据。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了抑制和/或敲除基因在提高单克隆抗体的表达量中的应用；

所述基因具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

I、具有基因degQ和/或degS的核苷酸序列；

II、具有如I所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；