[发明专利]一株埃博霉素D高产菌及其在发酵产埃博霉素D中的应用

说明书

本发明公开了一株埃博霉素D高产菌及其在发酵产埃博霉素D中的应用，所述菌株分类命名为纤维堆囊菌（Sporangium cellulosum）SPD‑1935，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC NO：M2018531，在摇床发酵实验中诱变菌株埃博霉素D达到436.27mg/L，相比于出发菌株的1.35mg/L的产量提高了323倍；同时在检测过程中发现有微量埃博霉素C存在，但是并没有发现有埃博霉素A和B的产生。经过连续5次传代培养其埃博霉素D的产量并无明显变化，表示其遗传稳定性良好。本发明菌株完全符合工业化生产埃博霉素D的生产技术指标，可用于大规模工业化发酵生产。

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一株埃博霉素D高产菌及其在发酵产埃博霉素D中的应用。

背景技术

粘细菌属于革兰氏阴性细菌，具有复杂多细胞行为的细菌。大约有12属40种，大多种都可以产生大量的次级代谢产物，产生埃博霉素的属于纤维堆囊菌（Sporangiumcellulosum）。纤维堆囊菌生长速度缓慢，达到对数生长期大约要16h，且野生型纤维堆囊菌在合成埃博霉素是产量极低，同时在培养过程中极易感染其他菌种。

埃博霉素(epothilone)是一类大环内酯类化合物，由德国国家生物技术中心(GBF)的G. Höfle等人于1993年首次报道。研究表明纤维堆囊菌菌株发酵液中可以分离埃博霉素。埃博霉素具有比紫杉醇优越的抗肿瘤特性：①埃博霉素比紫杉醇水溶性好，结构简单，有利于化学合成埃博霉素及结构衍生化。②埃博霉素没有紫杉醇细胞内毒素活性。③与紫杉醇不同，埃博霉素在P糖蛋白表达型的多药耐药性细胞中也维持很大的细胞毒性。

生产埃博霉素的方法有化学合成法和生物合成法。其中埃博霉素A有6种合成方法，埃博霉素B有11种，埃博霉素C和D有两种。由于化学合成杂质多，效率低，所以现今主要应用的方法是生物合成法。生物合成法主要是通过粘细菌发酵产生埃博霉素。

埃博霉素作为极其有潜力的抗癌新药，引起了全世界的化学家、生物学家及药学家的极大兴趣和研究热情。从1993年发现至今十多年时间，有关埃博霉素的研究报告达500多篇，并且在埃博霉素的临床试验中，迄今为止已有六种埃博霉素类化合物。如:百美时施贵宝（Squibb）公司的埃博霉素B的另一个半合成类似物BMS-310750；诺华（Novartis）公司的埃博霉素B（EPO906）及其类似物（ABJ879）；还有罗氏（Roche）公司的埃博霉素D(KOS-862)和埃博霉素D的类似物 KOS-1584；以及先灵（Schering）公司的埃博霉素B的类似物ZK-Epo。

大量的临床研究结果显示出该类化合物有极大的药用价值，2007年10月16日，美国FDA批准了埃博霉素B的半合成类似物IXEMPRA(TM) (伊沙匹隆，ixabepilone，BMS-247550) 用于乳腺癌的治疗，这引起了全行业的振奋。

埃博霉素D 及其内酰胺衍生物(Aza-epothilone D)实验证明它具有较强的抑制微管解聚功能，是一种候选抗癌药物。但是目前所有合成埃博霉素D的方法，都无法维持正常需求。Julien通过基因工程技术使得埃博霉素合成酶基因簇在黄色黏球菌中表达，最高产量85mg/L 。2006年，Mutka等通过基因工程技术使得大肠杆菌种埃博霉素C和D仅仅能够达到LC-MS检测水平。阎家麒通过在纤维堆囊菌ATCC15384发酵培养中使用P450埃博霉素环氧酶的一种抑制剂，该抑制剂特异性抑制epoK 基因产物的生成，使得生产菌株只产生埃博霉素D和C ，而不产生埃博霉素A和B 。

生产埃博霉素的的方法有化学合成法和生物合成法。由于化学合成杂质多，效率低，所以现今主要应用的方法是生物合成法。生物合成法主要是通过粘细菌发酵产生埃博霉素。发酵法产生的主要是埃博霉素A和B，目前国际上通过粘细菌发酵合成埃博霉素的产量较低，美国施贵宝达到228mg/L（A:B=1:6），国内李越中等人通过研究改良能达到180mg/L（A:B=2），但是现在并没有关于大规模生产埃博霉素D的报道，所以本发明旨在选育一种新的高产埃博霉素D的菌种，并应用到大规模生产中。