[发明专利]菌株及其构建方法，以及其用于发酵生产耐高温黄原胶的应用

权利要求书

1.野油菜黄单胞菌，其特征在于，在敲除了丙酮酰基转移酶基因gumL基因的野油菜黄单胞菌中添加乙酰基转移酶基因gumFG基因，

所述丙酮酰基转移酶基因gumL基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:29所示；

所述gumFG基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:30所示。

2.如权利要求1所述的野油菜黄单胞菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：扩增获得gumFG基因，以表达质粒pBBRMCS为骨架，向所述表达质粒pBBRMCS上的多克隆位点插入gumFG基因，构建乙酰基转移酶基因gumF、gumG的表达质粒pBBR-gumFG；

步骤2：将重组质粒pBBR-gumFG转化至E. coli-1 S17菌株，筛选正确的转化子，得到重组菌株E. coli-1 S17/pBBR-gumFG；

步骤3：将重组菌株E. coli-1 S17/pBBR-gumFG接合转移至△gumL菌株，Cm^r、Kan^r双抗平板筛选重组菌株，获得gumL基因敲除及添加gumFG基因的△gumL::gumFG菌株；

所述gumL基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:29所示；

所述gumFG基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:30所示；

所述△gumL菌株的构建方法包括如下步骤：

步骤1：扩增获得gumL上下游同源臂基因，通过overlap PCR将gumL基因的上下游同源臂连接，以自杀质粒pLO3为骨架，向质粒上的多克隆位点插入gumL基因的上下游同源臂片段，构建获得丙酮酰基转移酶基因gumL的敲除质粒pLO3-ΔgumL；

步骤2：将敲除质粒pLO3-ΔgumL转化至E. coliS17菌株，获得转化子，得到重组菌株E.coliS17/pLO3-ΔgumL；

步骤3：将所述重组菌株E. coliS17/pLO3-ΔgumL接合转移至野油菜黄单胞菌NRRL B-1459，Cm^r、tet^r双抗平板筛选单交换菌株，蔗糖致死筛选获得缺失gumL基因的双交换菌株△gumL。

3.野油菜黄单胞菌，其特征在于，在如权利要求1所述的野油菜黄单胞菌中添加黄原胶聚合输出蛋白表达基因gumBC基因，所述gumBC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:31所示。