[发明专利]一种铜绿假单胞菌基因工程疫苗候选抗原rExoU的纯化方法

权利要求书

1.一种重组工程菌pGEX-6p-2-rExoU/XL-1blue，其特征在于，所示重组工程菌pGEX-6p-2-rExoU/XL-1blue表达抗原rExoU的核酸序列如SEQ ID NO：1所示、氨基酸序列如SEQID NO：2所示。

2.一种利用权利要求1所述重组工程菌pGEX-6p-2-rExoU/XL-1blue的铜绿假单胞菌基因工程疫苗候选抗原rExoU的纯化方法，其特征在于，所述铜绿假单胞菌基因工程疫苗候选抗原rExoU的纯化方法包括步骤：收集表达rExoU的基因工程菌；按照高压破菌、离心，GST亲和纯化；SP HP层析纯化，G 25层析纯化，Q HP层析纯化的顺序组合对制备的抗原进行纯化；

所述铜绿假单胞菌基因工程疫苗候选抗原rExoU的纯化方法具体包括步骤：

1)高压破菌

收集表达rExoU的基因工程菌，用pH为7.0-7.5的PBS缓冲液混匀悬浮，预冷后采用高压匀浆破菌，高速离心，收集上清；

2)GST亲和纯化

GST亲和层析填料进行初步纯化，采用PBS洗脱杂蛋白后，用预分解蛋白酶切洗脱目标蛋白，酶切和洗脱缓冲液为A液；

3)SP HP层析纯化

经步骤2)收集的目标蛋白，用A液平衡层析系统及SP HP层析柱后上样，B液线性梯度洗脱；

4)G 25层析纯化

将经步骤3)纯化的目标蛋白，C液平衡层析系统及G25层析柱后上样，置换缓冲液；

5)Q HP层析纯化

将经步骤4)纯化的标蛋白，C液平衡层析系统及Q HP层析柱后上样，去除痕量非目标蛋白、内毒素杂质，获得目标蛋白；

其中，A液为pH值7.0-7.5的20mM Na₂ HPO₄-NaH ₂PO₄缓冲溶液，B液为pH7.0-7.5的20mMNa2HPO 4-NaH₂ PO ₄，1M NaCl缓冲溶液，C液为pH6.0的10mM组氨酸，0.9％NaCl缓冲溶液，PBS缓冲液为A液加入150mM NaCl；

所述步骤1)所述的高压匀浆破菌采用60-80MPa压力，破菌后高速离心获取破菌上清；

所述步骤2)的GST亲和层析使用的填料为Glutathione Sepharose 4B或GlutathioneSepharose4FF或Glutathione Sepharose HP；

所述步骤2)的预分解蛋白酶带有GST标签；

所述步骤3)的SP HP层析柱的填料为SP Sepharose HP或SP Sepharose FF或CaptoSP；

所述步骤4)的G 25层析柱的填料为Sephadex G-25Coarse或Sephadex G-25Medium或Sephadex G-25Fine或Sephadex G-25Superfine；

所述步骤5)的Q HP层析柱的填料为Q Sepharose HP或Q Sepharose FF或Capto Q。