[发明专利]3-氨基-4-羟基苯胂酸乙酰基转移酶基因EnhoA2及其编码蛋白与应用

说明书

本发明属于生物技术和生物医药领域，具体涉及3‑氨基‑4‑羟基苯胂酸乙酰基转移酶基因EnhoA2及其编码蛋白与应用。本发明中描述的3‑氨基‑4‑羟基苯胂酸乙酰基转移酶基因EnhoA2的全长768bp，序列如SEQ ID NO.1所示，EnhoA2编码的蛋白ENhoA2含255个氨基酸，序列如SEQ ID NO.4所示，EnhoA2及其同源基因可用于构建制备乙酰胂胺的基因工程生物或直接用于乙酰胂胺的酶法制备，EnhoA2基因及其编码产物的发现在生物技术和生物医药领域具有重要的理论和应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术和生物医药领域，具体涉及3-氨基-4-羟基苯胂酸乙酰基转移酶基因EnhoA2及其编码蛋白与应用。

背景技术

乙酰胂胺(CAS号：97-44-9)，别名阿西太松、乙酰胺胂、醋氨胂，分子式为C₈H₁₀AsNO₅，英文简写N-AHPAA，是一种抗阿米巴病药及抗滴虫病药，其复方制剂名为滴维净，临床上它通常被用作耐甲硝唑滴虫病治疗的首选药物。目前，该药物的生产制备是通过化学合成法来完成的，其中最简单、直接的合成步骤如下：以3-氨基-4-羟基苯胂酸(英文简写3-AHPAA)为原料，将其加入5％的氢氧化钠溶液中，搅拌使原料全溶，调节反应液pH＝8.0，并加热至30-35℃，之后在剧烈搅拌下加入乙酐进行反应，待沉淀开始析出后，继续搅拌1h，于55-60℃下向反应液中加入盐酸，析出的结晶经过滤和水洗等步骤后即为粗品乙酰胂胺。通过上述描述，我们可以发现化学合成法的操作步骤相对比较繁琐，且对反应条件及反应设备都有一定的要求，这些都是造成化学合成法实施成本较高的重要原因，另外我们也不能忽略化学合成过程中可能造成的废渣污染问题。酶学合成法是近些年极力提倡的绿色合成技术的重要组成部分，它不仅在工艺生产上不会对环境产生危害，同时它的运行成本及对反应条件的要求通常低于化学合成法，然而，到目前为止，尚未见有任何关于乙酰胂胺酶学合成的报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供可用于酶法制备乙酰胂胺的3-氨基-4-羟基苯胂酸乙酰基转移酶基因EnhoA2。

本发明的另一目的是提供乙酰基转移酶基因EnhoA2编码的乙酰基转移酶EnhoA2。

本发明的又一目的是提供该基因、蛋白的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

乙酰基转移酶基因EnhoA2，其核苷酸序列为：SEQ ID NO.1。

本发明中乙酰基转移酶基因EnhoA2克隆自一株能够在好氧条件下转化洛克沙胂的菌株Enterobacter sp.CZ-1。菌株CZ-1保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2018789，保藏日期2018年11月12日。通过前期对代谢产物进行分析鉴定，我们发现菌株CZ-1中存在着一条主要的洛克沙胂生物转化途径，即进入该菌体的洛克沙胂首先会被还原转化为3-氨基-4-羟基苯胂酸，之后又将迅速地转化为乙酰胂胺，因而我们推测在菌株CZ-1体内应该存在着可以将3-氨基-4-羟基苯胂酸直接转化为乙酰胂胺的酶类。

克隆3-氨基-4-羟基苯胂酸乙酰基转移酶采用的方法是常规的异源表达法。从菌株CZ-1的基因组中检索到33个乙酰基转移酶编码基因，将它们分别通过PCR反应扩增出来，扩增产物分别连接到表达载体pET29a(+)上，获得的重组质粒再分别转入大肠杆菌【BL21(DE3)】感受态细胞中，通过比较获得的阳性克隆子对3-氨基-4-羟基苯胂酸的乙酰化能力，我们从上述33个候选基因中鉴定到一个3-氨基-4-羟基苯胂酸乙酰基转移酶编码基因ENhoA2，接着我们通过生物化学手段对这个基因的编码产物ENhoA2的酶学特性进行了详细的研究。

乙酰基转移酶基因EnhoA2所编码的乙酰基转移酶ENhoA2，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。