[发明专利]一种筛选抗氧化活性肽的方法

说明书

本发明涉及一种筛选抗氧化活性肽的方法，属于生物技术领域，该方法是先用D‑半乳糖皮下注射造模筛选出衰老小鼠，再无菌分离衰老小鼠脾细胞、淋巴细胞，以衰老小鼠脾细胞、淋巴细胞为实验对象，进行相关的抗氧化肽或者抗氧化物质的活性筛选与验证实验；一种筛选抗氧化活性肽的方法以衰老小鼠细胞为实验对象，既有细胞实验的优点，又满足衰老的状态，避免采用氧化损伤剂诱导细胞氧化应激导致活性氧增加，建立细胞损伤模型带来对实验结果的影响，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种筛选抗氧化活性肽的方法，属于生物技术领域。

背景技术

近二十年来，活性氧(reactive oxygen species，ROS)和自由基的研究成为现代生命科学的前沿和热点，评价和筛选具有强抗氧化活性的天然资源成为生物学、医学和食品科学研究的新趋势。生物体内的天然抗氧化剂主要有还原型谷胱甘肽和肌肽，但含量很低，寻找外源性抗氧化剂一直是研究的重点，其中抗氧化肽的研究最为热点。酶解法是目前制备抗氧化肽的主流方法。

抗氧化活性物质的研究开发过程中,活性评价方法至关重要。国内外没有一种精确、简便的能全面评价抗氧化物质抗氧化活性的方法，很多研究者致力于寻找合适的评价方法。

1、体外化学测定法。包括清除自由基、还原金属离子、抑制脂质过氧化评价法。体外化学法简单，有易于操作、快捷、处理量大等优点而被广泛应用。但体外化学法不能真实模拟或反映机体内部生理环境及综合因素相互作用的复杂过程，其结果并不直接和体内抗氧化能力相关，也无法阐明其机理。2、动物试验法。可以使用老龄大鼠或老龄小鼠，也可用氧化损伤模型鼠，常见的有D－半乳糖氧化损伤模型、乙醇氧化损伤模型、CCl₄氧化损伤模型。动物实验结果具有直接说明意义，但昂贵耗时，尤其不适宜初期筛选，目前在抗氧化领域采用动物实验者不多。3、细胞培养模型法。以细胞培养为基础的细胞模型法可以研究药物进入细胞膜、药物吸收、与载体或酶等生物大分子相互作用以及清除细胞内氧自由基的作用，能更准确更接近地阐述在生物体内的抗氧化活性及机理，近几年来，越来越受到重视。目前，细胞培养模型法的一般做法是采用氧化损伤剂(如H₂O₂等)诱导细胞氧化应激导致活性氧增加，建立细胞损伤模型，研究添加抗氧化剂对氧化损伤细胞的保护作用。细胞培养模型法也存在不足。首先，有研究发现，无限增殖的细胞株不是细胞损伤模型的合适选择，有些无限增殖的细胞株在氧化损伤剂诱导的氧化应激情况下表现出功能应答的改变，此外，大部分无限增殖的细胞株是超二倍体，进行非对等细胞分裂，致使部分细胞功能障碍与渐进式死亡(凋亡)，导致线粒体产生活性氧，这有导致混淆数据的潜在可能，而对肿瘤细胞的氧化保护作用也不是可取的结果。其次，所使用的化学氧化损伤剂可以在短时内使细胞暴露在外源高自由基环境，但这与衰老、疾病导致的相关的氧化应激状态是不相同的。一定浓度的H₂O₂才能产生足够的自由基浓度，而高浓度的H₂O₂对细胞来说是不符合生理且是有毒性的。寻找更合适的细胞评价模型，是十分必须的。

我国学者龚国清基于衰老的代谢学说复制的D-半乳糖致衰老模型，自1991年提出以来在国内得到广泛运用和发展，也得到国外学者肯定和接受。哺乳动物从乳糖中获得半乳糖有三种代谢途径：Leloir通路，醛糖还原酶通路及半乳糖氧化酶通路。当机体细胞内大量半乳糖堆积，不能通过Leloir和醛糖还原酶通路及时代谢，在半乳糖氧化酶作用下，生成醛类和H₂O₂以及超氧阴离子，这些物质不能被细胞进一步代谢，细胞中脂质、蛋白和核酸因氧化应激产生自由基损伤、非酶糖基化作用等导致细胞肿胀和功能障碍，引起全身各器官受损、系统功能衰退等一系列病理变化，促成衰老发生。由此，我们推测，从D-半乳糖致衰老小鼠脾中分离的淋巴细胞，可以作为抗氧化肽活性筛选的细胞损伤模型。

经过检索，关于抗氧化肽及其制备方法方面的专利很多，但是关于筛选抗氧化活性肽的方法未见有相关专利申请。

发明内容