[发明专利]邻苯二酚降解相关四个基因的优化重组与应用

说明书

本发明公开了一种优化后适用于大肠杆菌表达的邻苯二酚降解相关的四个基因及其应用。每个基因都由独立的T7启动子和终止子控制，其核苷酸序列分别如SEQ ID No 1、SEQ ID No 2、SEQ ID No 3和SEQ ID No 4所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列分别如SEQ ID No 5、SEQ ID No 6、SEQ ID No 7和SEQ ID No 8所示。本发明优化合成的基因能够在大肠杆菌中成功表达，可用于制备降解邻苯二酚的微生物。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及结构优化的邻苯二酚降解相关四个基因的序列。

技术背景

环境问题是人类当前面临的严峻挑战。环境中的有机污染物种类繁多、性质多样、分布广泛、对人类和其它生物危害大且难以降解，一直是污染防治中的一个难题。邻苯二酚，又名儿茶酚，是苯的两个邻位氢被羟基取代后形成的化合物，是许多种芳香族化合物如苯、甲苯、萘、苯酚等微生物降解的重要中间体，对动物和人类都有毒害作用，是一种致癌物，其毒性大于苯酚。邻苯二酚同时也是一种重要的化工产品，常被用于农药合成、人工香料合成、医药合成、阻聚剂、热稳定剂、防腐、照像、化学分析试剂等。随着邻苯二酚使用量的增加，排入环境中的邻苯二酚也相应增加，所造成的污染也日益严重。

对于环境中污染物的修复，包括物理修复、化学修复和生物修复。物理修复包括沉淀法、加热法、萃取法、洗涤法和吸附法等。化学修复包括湿式氧化法、光催化氧化法、超临界水氧化法和声化学氧化法等。而与物理和化学修复相比，生物修复具有成本低、处理效果好且无二次污染是极具潜力的污染修复方法。

Ornston于1966首次在恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）发现并阐明了邻苯二酚完全降解的代谢途径，随后陆续在多种土壤细菌和真菌也中发现这一途径。它是由7个基因编码的6步酶促反应，以邻苯二酚为底物最终将其转化为乙酰辅酶A和琥珀酰辅酶A，进入三羧酸循环而为微生物所利用（参见图1）。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供能够在大肠杆菌中表达的邻苯二酚降解相关四个基因：catA基因，编码邻苯二酚1,2双加氧酶；catB基因，编码粘康酶内酯酶；catC基因，编码粘康酸内酯异构酶；catD基因，编码β-酮己二酸内酯水解酶。邻苯二酚经过连续四步酶促反应生成β-酮己二酸。基于Rhodococcussp. AN-22菌原始catA、catB、catC和catD基因，本发明只保留每个基因的编码序列，并分别连接上独立的T7启动子和终止子调控其表达。同时优化编码区基因结构，遵循以下原则：（一）优化基因密码子，提高基因翻译效率。（二）消除基因内部的常用限制性内切酶的识别位点，便于表达盒构建。（三）消除逆向重复序列、茎环结构和转录终止信号，使基因内部的GC/AT均衡，提高RNA的稳定性。（四）使基因编码蛋白符合N端原则，以提高翻译蛋白的稳定性。（五）优化mRNA二级结构自由能，以提高基因表达效率。值得指出的是，本发明对密码子的优化同时还兼顾了植物的密码子偏爱。

所述经优化的邻苯二酚降解相关四个基因的核苷酸序列如SEQ ID No 1、SEQ IDNo 2、SEQ ID No 3和SEQ ID No 4所示。每个基因两端分别边上T7启动子与终止子，完整序列两端分别连接EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点，全长序列由南京金斯瑞公司合成（参见图2）。

将合成的基因片段经EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切后，连入相同酶切的载体pET-28a，得到重组质粒pET-CAT，并将其转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到阳性株系。

阳性菌株在100毫升M9(含1%甘油和50μg/ml卡那霉素)液体培养中37℃摇菌24小时，离心去上清，菌体用10毫升M9(含1%甘油、0.2%阿拉伯糖、50μg/ml卡那霉素和1mM IPTG)液体培养基重悬，向其中添加不同浓度的邻苯二酚，结果证明阳性菌株能够有效去除培养基中的邻苯二酚。